Патент на изобретение №2238975

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI КМ 147 – ПРОДУЦЕНТ В-СУБЪЕДИНИЦЫ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к конструированию штамма кишечной палочки – продуцента холерного токсина, и может быть использовано для создания диагностической тест-системы, позволяющей выявлять токсигенные клоны Vibrio cholerae и Escherichia coli, а также для конструирования живых вакцинных штаммов против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V.cholerae и Е. coli. Авирулентный штамм E.coli KM 147 – активный продуцент протективного антигена получают путем коньюгативного введения в клетки рекомбинантной плазмиды pIEM3 с клонированным геном В-субъединицы холерного токсина. Изобретение позволяет получить непатогенный для человека и животных штамм с высокой продукцией основного протективного антигена V.cholerae (В-субъединицы холерного токсина).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к конструированию штамма кишечной палочки – продуцента холерного токсина, и может быть использовано для выделения очищенной иммуногенной В-субъединицы холерного токсина, входящей в состав диагностической тест-системы, позволяющей выявлять токсигенные клоны Vibrio cholerae и Escherichia coli. Кроме того, созданный штамм может служить в качестве основы для конструирования живых вакцинных штаммов против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V.cholerae и E. coli.

Также известен штамм V.cholerae KM93 II группы патогенности. который является продуцентом В-субъединицы холерного токсина, выделяемой в среду выращивания. Количество В-субъединицы у данного штамма холерного вибриона составляет 8,5 мкг/мл (авторское свидетельство СССР №1505022, МКИ C 12 N 15/00).

Задача изобретения – конструирование непатогенного для человека и животных штамма с высокой продукцией одного из основных протективных антигенов В-субъединицы холерного токсина.

Сущность изобретения заключается в том, что получен авирулентный штамм Escherichia coli – продуцент В-субъединицы холерного токсина (основного протективного антигена).

Заявляемый штамм создан на основе хорошо изученного авирулентного штамма E.coli М 17 (являющегося основой профилактического препарата колибактерина) путем коньюгативного введения в клетки этого штамма рекомбинантной плазмиды: рIЕМ3 (Km^rTc^r) с клонированными генами холерного токсина (ctxB). Данная плазмида представляет собой коньюгативный коинтеграт, состоящий из двух плазмид pIEM1 (производная плазмиды рОХ38, содержащей транспозон mini-kan и IS1-последовательность) и рСТ27 (производная плазмиды pBR322, несущая ген резистентности к тетрациклину (Тc^r), и клонированный фрагмент хромосомы штамма биовара эльтор V.cholerae RV79 с геном ctxB, детерминирующим синтез В-субъединицы холерного токсина).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ “Микроб” (г.Саратов) под номером КМ 147.

Характеристика штамма Escherichia coli KM147.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие, оксидазоотрицательные.

Патогенные свойства.

Штамм является непатогенным для человека и животных.

Культуральные свойства.

Хемоорганотроф, каталазоположительный. Растет на питательных средах при оптимальной температуре 37С при рН 7.2, образуя ровную интенсивную муть. Прототроф.

Плазмидный состав.

Штамм КМ 147 содержит плазмиду рIЕМ3, несущую структурный ген ctxB, детерминирующий биосинтез В-субъединицы холерного токсина, а также гены устойчивости к тетрациклину и канамицину. Основные свойства штамма:

– высокий уровень продукции В-субъединицы холерного токсина в среду выращивания – 10 мкг/мл;

– способность к выработке антитоксических антител у иммунизированных животных;

– стабильность – сохраняет свойства при хранении и культивировании на питательных средах, а также в организме лабораторных животных;

– безопасен для лабораторных животных.

Пример 1. Определение стабильности наследования рекомбинантной плазмиды в клетках штамма.

Стабильность плазмиды рIЕМ3 определяли путем выращивания штамма в неселективных условиях в течение 48-72 часов на LB бульоне при 37С. затем рассевали до моноколоний на LB агаре. Полученные трансконъюганты проверяли по маркерам резистентности плазмиды, т.е. определяли устойчивость к канамицину (50 мкг/мл) и тетрациклину (10 мкг/мл), кодируемую плазмидой рIЕМ3. Были отобраны моноплазмидные клоны со 100%-ной стабильностью наследования плазмиды р1ЕМ3 для последующих исследований.

Стабильность введенной рекомбинантной плазмиды проверялась также в условиях in vivo при пассажах рекомбинантного штамма в организме лабораторных животных – белых мышах и крольчат-сосунках. Установлено, что при пассировании штамма E.coli KM147 в течение 48 часов в организме белых мышей (внутрибрюшинное заражение в дозе 110⁷ м.т.) и последующем высеве его на неселективный агар все выросшие клоны содержали в их клетках плазмиду – р1ЕМ3 (Кm^rТс^r).

Крольчата-сосунки заражались указанным штаммом внутрижелудочно (110⁴ м.т.). Через 48 часов после заражения высеянные на полноценный агар моноколонии проверялись на наличие плазмидных маркеров резистентности к антибиотикам Установлено, что после 48-часового пребывания в кишечнике крольчат 100% изученных клонов сохраняли репликой – pIEM3(Km^rTc^r).

Пример 2. Определение продукции протективного антигена.

Для оценки экспрессии гена В-субъединицы холерного токсина в сконструированном штамме E.coli KM147 была использована реакция пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде и иммуноферментный метод (ELISA). Но данным РПИГ введенный ген ctxB эффективно экспрессировался в клетках штамма E.coli KM147. Зона иммунного гемолиза эритроцитов вокруг макроколоний изучаемого штамма заметно превышала размер зоны гемолиза вокруг макроколоний высокотоксигенного штамма V.cholerae 569B.

Продукцию холерного токсина определяли также высокочувствительным количественным иммуноферментным методом ELISA. Установлено, что по результатам этого метода сконструированный штамм продуцирует в среду выращивания 10.0 мкг/мл В-субъединицы холерного токсина, что почти в 12 раз превышает продукцию в ранее созданном штамме-продуценте этого антигена E.coli KS3043 (0,85 мкг/мл).

Кроме того, если в клетках рекомбинантных штаммов E.coli, содержащих клонированный ген В-субъединицы холерного токсина, более 98% продуцируемой В-субъединицы остается в периплазме, а не секретируется наружу, то в созданном нами штамме E.coli KM147 продуцируемый антиген секретируется наружу.

Пример 3. Определение специфической безвредности рекомбинантного штамма.

Безвредность сконструированного штамма была изучена на модели белых мышей и кроликов-сосунков. Белых мышей заражали внутрибрюшинно 1 мл суспензией клеток в дозе 110 м.т. За период наблюдения (7 дней) гибели зараженных животных не наблюдалось, физиологические показатели оставались в норме. По истечении указанного времени животных забивали и определяли наличие макроскопических изменений в кишечнике. У всех опытных животных не было отмечено никаких макроскопических изменений в толстом кишечнике – скопления жидкости в просвете слепой кишки и прилегающих к ней отделов. Кроликов-сосунков заражали внутрикишечно и внутрижелудочно в дозах 110⁹ и 510⁹ м.т. Животных наблюдали в течение 4 суток. Установлено, что введение рекомбинантного штамма E.coli KM147 не приводило к развитию диареи или гибели животных. У всех забитых животных не наблюдалось ни макроскопических, ни микроскопических изменений.

Пример 4, отражающий иммуногенные свойства.

Для изучения иммуногенных свойств рекомбинантный штамм E.coli KM147 внутрижелудочно вводили взрослым кроликам в дозе 10¹⁰ м.т. Антигенное действие изучаемого штамма определялось путем выявления в сыворотке крови антитоксических антител. Накопление указанных антител определяли в динамике (сыворотку крови от животных получали на 7, 14, 21, 28, 35, 42 и 49 дни). Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 28 дней. Полученную сыворотку для удаления гетерологичных антител сорбировали клетками исходного штамма. По результатам высокочувствительного ДОТ-иммуноанализа (качественный метод) сыворотки иммунизированных животных содержали антитела к В-субъединице холерного токсина. Количественная оценка образования изучаемых антител проводилась с помощью иммуноферментного метода ELISA (определение антител к В-субъединице холерного токсина).

При определении уровня антител к В-субъединице холерного токсина при помощи иммуноферментного метода ELISA было выявлено, что максимальный титр (1:3200) антитоксических антител регистрировался на 35 день иммунизации и сохранялся на протяжении всего срока наблюдения.

Таким образом, заявляемый штамм обладает высоким уровнем продукции В-субъединицы холерного токсина, являющейся основным протективным антигеном, обеспечивающим формирование антитоксического иммунитета. Штамм безопасен для лабораторных животных независимо от способа введения в организм. Указанные свойства рекомбинантного штамма E.coli KM147 свидетельствуют о том, что штамм может использоваться для выделения очищенной иммуногенной В-субъединицы холерного токсина и последующего приготовления антисыворотки для выявления токсигенных штаммов; для последующего создания диагностической тест-системы, позволяющей выявлять токсигенные клоны V.cholerae и как основа для конструирования вакцинных штаммов против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V.cholerae и E.coli.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli КМ147 – продуцент В-субъединицы холерного токсина.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.02.2006

Извещение опубликовано: 20.02.2007 БИ: 05/2007

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.05.2008

Извещение опубликовано: 27.05.2008 БИ: 15/2008