Патент на изобретение №2238972

(54) ШТАММ БАКТЕРИИ BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS 22-ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-CCNNNNN^NNGG-3′, И ОБЛАДАЮЩИЙ РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ СЕМЯН КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерии Bacillus stearothermophilus 22 – продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-CCNNNNN^NNGG-3′ и обладающий свойством ростостимулирующей активности. Bacillus stearothermophilus 22 – продуцент рестриктазы Bst22I, выделен из почвы горячих источников п-ова Камчатка в результате поиска продуцентов рестриктаз. Обеспечивает получение рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-CGNNNNN^NNGG-3′. Выход фермента составляет 50000 Е/г сырой биомассы. Рестриктаза Bst22I является изошизомером рестриктазы BsiYI и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. Биомасса клеток бактериального штамма обладает ростостимулирующей активностью в отношении семян различных культурных растений. 4 ил., 3 табл.

Изобретение относится к поиску новых штаммов – продуцентов биологически активных веществ, перспективных для микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5’-CCNNNNN^NNGG-3’ и обладающего свойством влиять на прорастание семян различных культурных растений.

Рестриктаза данной специфичности используется для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов и редко встречается в природных штаммах.

Известно несколько продуцентов – изошизомеров этой рестриктазы, однако в литературе нет подробного описания данных штаммов и их ферментов.

Известны несколько штаммов [1, 2], способных продуцировать рестриктазу (сайт узнавания 5’-CCNNNNN^NNGG-3’).

Нет данных о стимулирующих рост растений свойствах клеток.

Известны питательные композиции для стимуляции роста растений [3, 4]. Они содержат штаммы Bacillus и их культуральные жидкости, а также микроэлементы, соли, аминокислоты, наполнители. Композиции представлены в сухом или жидком виде.

Недостатками этих композиций является сложность изготовления, присутствие мочевины, которая служит дополнительным источником нитратов, которые вредны для здоровья, а также отсутствие у используемых штаммов способности продуцировать рестриктазы.

Известен штамм Bacillus polymyxa, используемый для производства стимулятора роста сахарной свеклы [5]. Препарат, полученный на основе этого штамма, используется вместе с инсектицидными и фунгицидными препаратами на семенных заводах.

Фунгициды и инсектициды являются факторами риска для сельскохозяйственных рабочих, также неизвестна способность этого штамма к продуцированию фермента эндонуклеазы рестрикции.

Известен стимулятор роста растений на основе рибонуклеазы, полученной синтезом В. iniermedius 7p [6].

Штамм не обладает активностью к синтезу фермента эндонуклеазы рестрикции.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм В. stearothermophilus, продуцирующий рестриктазу BsiYI [7], прототип.

Фермент сохраняет активность от двух до восьми месяцев хранения при -20С в зависимости от метода выделения. Выход фермента составляет 1200 ед/г препарата.

Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Недостатком данного штамма является невысокий выход рестриктазы и отсутствие ростостимулирующей активности.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5’-CCNNNNN^NNGG-3’, с высоким выходом фермента, стабильного при хранении и обладающего ростостимулирующей активностью в отношении семян культурных растений.

Поставленная техническая задача решается выявлением и использованием штамма – продуцента сайт-специфической рестриктазы Bst22 I и обладающего ростостимулирующей активностью.

Предлагаемый штамм выделен из образцов почвы термального источника Верхняя Паратунка полуострова Камчатки в результате поиска новых продуцентов биологически активных веществ.

Бактериальный штамм Bacillus stearothermophilus 22 характеризуется следующими признаками.

Морфология: клетки штамма – подвижные палочки размером (0,6-0,8)(3,0-6,0) мкм, грамвариабельные. Образуют эллипсовидные споры (1,5-2,5) мкм. Поверхность спор гладкая, спороносны прямые.

Физиологические и биохимические свойства: аэроб, температурный оптимум 55-65С, наблюдается рост при 42С. рН среды – 7,0-7,2. Штамм интенсивно ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, галактозу, маннит, слабо – инозит, не ферментирует сорбит; восстанавливает нитраты, не выделяет индол, амилазо-каталазо-положительный.

Вид идентифицирован по определителю [8] как штамм бактерии Bacillus stearothermophilus 22.

Полученный штамм Bacillus stearothermophilus 22 депонирован в НИИ ККМ Государственного Научного Центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” под регистрационным номером В-894, а продуцируемая им рестриктаза названа Bst22 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм хранится в лиофильном состоянии или в питательной среде под слоем вазелинового масла.

Для получения препарата фермента штамм выращивают в пол-литровых колбах на термостатированной качалке при 250 об/мин и 55С. Для культивирования Bacillus stearothermophilus 22 применяют L-бульон [9]. Полученную бактериальную биомассу хранят при – 20С.

Все операции по выделению Bst221 проводят при температуре 4-5С. Клетки суспендируют в буфере А (10 мМ калий фосфатный буфер рН 7.5, 7 мМ -меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА) из расчета 4 мл на 1 г биомассы и разрушают постадийно ультразвуком на дезинтеграторе (“MSE”, Англия), затем осветляют центрифугированием на центрифуге J-21B (“Bekman”, США) со скоростью 18000 об/мин в течение 30 мин. Экстракт наносят на колонку (1.614 см) фосфоцеллюлозы Р-11 (“Whatman”, Англия), промывают буфером А и смывают фермент в градиенте концентрации NaCl (0.0-0.8 М) объемом 200 мл. Фракции, содержащие рестриктазу, диализуют против буфера В (10 мМ трис-HCl pH 7,5, 1 мМ – меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА). Затем фермент наносят на колонку (0.89см) ДЭАЭ – целлюлозы ДЕ – 52 (“Whatman”, Англия), промывают буфером В и смывают фермент в градиенте NaCl от 0 до 0.8 М объемом 40 мл. Фракции с ферментом диализуют против 50%-ного раствора глицерина в буфере В, содержащем 0.2 М NaCl и хранят при температуре -20С.

Выход фермента из 10 г клеток составляет 50000 ед. акт. За единицу активности (Е) принимают минимальное количество фермента, которое в течение 1 ч в оптимальных условиях полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага в 20 мкл реакционной смеси.

Полученный препарат фермента Bst22I проверяют на наличие примесей неспецифических нуклеаз и протеаз. Для этого используют тест 18-часовой инкубации фермента с ДНК [9], тест “рестрикция – сшивка – повторная рестрикция” [10] и тест на олигонуклеотидных субстратах.

Данный штамм является уникальным не только по наличию данной эндонуклеазы рестрикции, но и имеет дополнительные свойства. Клетки штамма синтезируют вещества, способные стимулировать рост растений, в частности прорастание семян различных культурных растений, таких как редис, морковь, огурцы, редька и др. Данные представлены в таблицах 1-3 и на фиг.2-4.

Результаты, представленные в таблицах показывают, что после обработки семян редиса, огурцов и редьки клеточным экстрактом данного штамма прорастание данных растений усиливается по сравнению с контролем как при 10-ти, так и 100-кратном разведении. В примере с семенами редьки сорта “Майская” проводят замеры “надземной и подземной” частями растения (табл.3)

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:

– высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип,

– высокая стабильность фермента (сохранение активности в течение двух лет хранения при -20С),

– широкий температурный оптимум работы фермента, в результате чего расширяется температурный спектр его использования,

– ростостимулирующая активность в отношении семян культурных растений.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения “новизна” и “изобретательский уровень”.

На фигуре 1 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bst22I (дор.1), Bst22I и Bsc4I (дор.2) Bsc4I (дор.3), (сайт узнавания 5’-CCNNNNN^NNGG-3’).

Как видно из представленной фигуры, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

На фигуре 2 представлены семена редиса, обработанные клеточным экстрактом штамма В. stearothermophilus 22 (1, 3, 4, 5, 6) и без обработки (2). Как видно из рисунка, и корневая и листовая часть проростков семян после обработки клеточным экстрактом отличаются от контрольных семян, обработанных только дистиллированной водой. Аналогичные данные получены и для проростков огурцов и редьки, представленные на фиг.3 и 4 соответственно.На фигуре 3 представлены семена огурцов, обработанные клеточным экстрактом штамма В. stearothermophilus 22 (1, 2, 5, 6) и без обработки (3, 4).

На фигуре 4 представлены семена редьки, обработанные клеточным экстрактом штамма В. stearothermophilus 22 (верхний ряд) и без обработки (нижний ряд).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента. Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Косяки помещают в термостат на 55С. После 10 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, содержащей следующие компоненты, г/л:

Пептон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, хлористый натрий – 5 г/л, вода дистиллированная – до 1 л, рН 7.2.

Культивирование проводят при 55С с аэрацией, при перемешивании – 250 об/мин. Клетки собирают центрифугированием на центрифуге J-21 при 5000 об/мин и температуре 4-5С. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят по описанной выше методике.

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента. Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (фиг.1). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5’-CCNNNNN^NNGG-3’.

Выход фермента определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 65°С. Выход фермента составляет 50 000 ед/г сырой биомассы. Фермент хранится при -20С в глицерине.

Пример 3. Определение термоустойчивости фермента. Гидролиз ДНК фага лямбда проводят в стандартных условиях, но при различных температурах от 42 до 70С. Фермент сохраняет свою активность в данных условиях, что подтверждает его широкий температурный спектр.

Пример 4. Определение активности фермента в зависимости от времени хранения при -20С. Определение активности проводят в стандартных условиях периодически в течение двух лет хранения.

Поскольку рестриктаза имеет сайт узнавания 5’-CCNNNNN^NNGG-3’ идентичный сайгу узнавания рестриктазы Bsc4 I, которая также является изошизомером BsiY I, она может заменить прототип во всех генноинженерных работах.

Пример 5. Биомассу клеток штамма Bacillus stearothermophilus 22, полученную в L-бульоне промывают физиологическим раствором, разрушают с помощью ультразвука в стандартном буфере и получают 10-ти и 100-кратное разведение клеточного экстракта. Для разведения берут стерильную дистиллированную воду. Полученный экстракт используют для замачивания семян редиса в течение 60 и 90 мин. В результате установлено, что прирост корневой системы данных семян увеличивается ~ в 3 раза по сравнению с контролем за один и тот же промежуток времени.

Пример 6. Пример аналогичен примеру 5. За исключением того, что используют семена моркови. Семена прорастают на 7-10 дней раньше, чем семена контроля, взятые без обработки клеточным экстрактом, а только водой.

Литература

1. Репин В.Е., Серов Г.Д., Пучкова Л.И., Терещенко Т.А., Лебедев Л.Р., Чижиков В.Е., (1993) Биоорган. химия, т. 19, №5, с.583-584.

2. Repin, V.E., Lebedev, L.R., Puchkova, L., Serov, G.D., Tereschenko Т., Chizikov, V.E., Andreeva, I., (1995) Gene, vol. 157, pp. 321-322.

3. Международная заявка №0036085, С 12 N 1/12, опубликовано ИСМ 46, 6/01.

4. Заявка Японии №1172310, A 01 N 63/02, опубликовано РЖ ИСМ 5-20-90.

5. Патент РФ №2035507, С 05 F 11/08, опубликовано БИ 14, 1995.

6. Авторское свидетельство СССР №1642973, А 01 N 63/00, опубликовано БИ 15, 1991.

7. Mok, Y.K., Clark, D.R., Kam, K.M., Shaw, P.C., (1991) Nucleic Acids Res., vol. 19, pp.2321-2323.

8. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1986, V.2, P.1105-1139.

9. Маниатис Р.А., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С.479.

10. Пучкова Л.И., Ушакова Т.А., Михайлова В.К., Серов Г.Д., Кривопалова Г.Н., Репин В.Е., (2002) Прикл. биохим. и микробиол., т.38, №1, с.20-24.

Формула изобретения

Штамм бактерии Bacillus stearothermophilus 22 (НИИ ККМ ГНЦ ВБ “ВЕКТОР” В-894) – продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-CCNNNNN^NNGG-3′, и обладающий ростостимулирующей активностью в отношении семян культурных растений.

РИСУНКИ