Патент на изобретение №2161650
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ МАЛЯРИИ PLASMODIUM FALCIPARUM
(57) Реферат: Изобретение относится к медицинской паразитологии, к способам культивирования малярийного паразита. При культивировании Plasmodium falciparum в питательную среду RPMI – 1640, дополнительно содержащую Hepes, сыворотку, карбонат натрия, добавляют антиоксидантные ферменты – супероксиддисмутазу (СОД) и каталазу. Данные ферменты выделяют из эритроцитов крови человека. Ферменты вводят в количестве, исключающем гемолиз эритроцитов. Способ увеличивает выход паразитов, и накопление биомассы происходит за более короткий срок. 1 табл. Изобретение относится к медицинской паразитологии, к способам культивирования малярийного паразита и может быть использовано для приготовления малярийного антигена. Известен способ получения биомассы возбудителя малярии P.falciparum (авторское свидетельство СССР N 1563700 A1, A 61 K 39/02, C 12 N 5/00, 1988). Способ основан на методе частых пересевов со свежими отмытыми и пропущенными через капиллярную колонку эритроцитами. Оценку результатов проводят в тонких мазках, подсчитывают паразитов на 1000 эритроцитов и выражают в процентах. Однако этот способ сопровождается гемолизом эритроцитов, задержкой роста и размножения паразитов. Для коррекции этих неблагоприятных изменений обычно используют способ частых пересевов, однако положительный эффект, т.е. стимуляция роста и размножения паразитов, наблюдается примерно в 50% случаев. Эритроциты, находящиеся в предгомолитическом состоянии и не пригодные для развития в них паразитов, препятствуют эффективному культивированию. Цель изобретения – повышение выхода биомассы возбудителя малярии Р.falciparum за счет улучшения состояния эритроцитов в культуре. Поставленная цель достигается тем, что при ежедневных пересевах в полную питательную среду RPMI – 1640 добавляют ингибиторы окислительных процессов – комплекс антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (патент N 2033169 от 20.04.95 г., МКИ A 61 K 35/1811, C 12 N 9/00 на изобретение “Способ получения комплекса супероксиддисмутазы и каталазы из эритроцитов крови человека”). Согласно предлагаемому способу готовят среду для культивирования из полной среды RPMI – 1640, Hepes (25 ммоль/л) + 10% сыворотка + 5% NaCO3, pH 7,2 + антиоксидантные ферменты СОД + каталаза). Количество ферментов, необходимое для оптимального роста и размножения паразитов, определяли путем добавления в полную питательную среду различных весовых количеств комплекса. Ежедневно культуральные клетки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 3-4 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают, к осажденным эритроцитам добавляют равный объем приготовленной питательной среды и получают 50%-ную суспензию клеток. После тщательного перемешивания в стерильных условиях к суспензии эритроцитов из культуры добавляют 50%-ную суспензию свежих отмытых эритроцитов, чтобы количество паразитов составляло 0,3-0,5%, затем прибавляют приготовленную полную питательную среду с комплексом ферментов. Суспензию тщательно перемешивают пастеровской пипеткой, разливают в культуральные чашки по 1,5 мл в каждую и продолжают культивировать. Пример. Из четырех культуральных чашек сливают содержимое в стерильную пробирку и перемешивают. Заливают полной питательной средой, в которую на 100 мл среды добавляют 5 мг комплекса ферментов (СОД + каталаза), центрифугируют, осадок разливают в 4-6 культуральных чашек, добавляют полную питательную среду с комплексом ферментов и продолжают культивировать (А) (таблица). При пересеве этих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают количество паразитов в мазке, окрашенном по Романовскому-Гимза. Добавляют в среду 7 мг комплекса ферментов на 100 мл полной питательной среды. Процентное количество паразитов 5-10 достигается за 48 часов (Б). Добавляют в питательную среду 10 мг комплекса ферментов на 100 мл (В), 7-12%-ное содержание паразитов в эритроцитах достигается за 24-48 часов. Добавляют комплекс ферментов 10 мг на 100 мл среды, что приводит к лизису зараженных эритроцитов (Г). Результаты исследования представлены в таблице. Таким образом предлагаемый способ сокращает сроки размножения паразитов малярии в культуре и повышает выход биомассы, что достигается при добавлении в полную питательную среду ингибиторов окислительных процессов (СОД + каталаза) в количестве 5-10 мг на 100 мл среды. Дальнейшее добавление комплекса в среду нецелесообразно, так как это приводит к разрушению эритроцитов, содержащих возбудители. Выход биомассы (т.е. количество паразитов на 1000 эритроцитов) значительно выше (в 2-4 раза) и происходит быстрее уже за 24 часа при включении предлагаемого способа в процесс культивирования. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 31.07.2000
Номер и год публикации бюллетеня: 6-2003
Извещение опубликовано: 27.02.2003
|
||||||||||||||||||||||||||
