Патент на изобретение №2334988

(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА (БТШ70)

(57) Реферат:

Изобретение относится к молекулярной биологии, медицине и фармацевтике, в частности к исследованиям белка in vitro. Сущность способа: определяют активность белка теплового шока (БТШ70), для чего подготавливают переживающие срезы нервной ткани мозга, инкубационную среду для срезов, проводят измерение и сопоставление параметров биоэлектрической активности до и после тестирующих воздействий. А именно, у приготовленных срезов регистрируют исходные параметры амплитуды N-метил-D-аспартатного возбуждающего постсинаптического потенциала (НМДА ВПСП), для определения амплитуды НМДА ВПСП срезы стимулируют электрическими импульсами прямоугольной формы, длительностью 0,1 мс, интенсивностью 10 В, с частотой 1 импульс в минуту, далее апплицируют (БТШ70) на все срезы в концентрации 1 мкг/мл, затем срезы одной группы тетанизируют электрическими импульсами с частотой 100/с, длительностью 30 с, срезы другой группы подвергают аноксическому воздействию путем замены кислородной атмосферы на азот в течение 10 мин, у всех срезов измеряют амплитуду НМДА ВПСП после воздействий. Способ позволяет стандартизировать условия проведения экспериментов и клинических испытаний с использованием БТШ70, исключить ошибки в эффектах, вызываемых белком при его применении с разными уровнями активности. 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”с.3-25. СОТТО JJ, MORIMOTO RI Stress-induced activation of the heat-shock response: cell and molecular biology of heat-shock factors., Biochem Soc Symp. 1999; 64:105-18. PMID: 10207624 [PubMed – indexed for MEDLINE]. MOKRUSHIN A.A et al. Heat shock protein HSP70 increases the resistance of cortical cells to glutamate excitotoxicity. Bull Exp Biol Med. 2005 Jul; 140(1):1-5, PMID: 16254606 [PubMed – indexed for MEDLINE].

Изобретение относится к молекулярной биологии и фармацевтике, в частности к исследованиям свойств белка. Известен способ исследования свойств белка in vitro, включающий подготовку его, препаратов переживающих срезов мозга, измерение и сопоставление параметров исходных и после тестирующих воздействий и обработку результатов сопоставления (прототип) [4].

Клетки всех живых организмов в ответ на действие стрессорных факторов отвечают усилением синтеза так называемых белков стресса. Один из них белок теплового шока, имеющий молекулярный вес 70 кДа (БТШ70), появляется в клетках после воздействия на них высокой температуры. Установлено, что БТШ70 необходим клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов как ксенобиотических, так и аксенобиотического происхождения. БТШ70 обнаружен в клетках различных тканей организма, в том числе и нервной.

По выполняемым функциям в клетках этот белок относится к защитным белкам. При характеристике протективной функции БТШ70 говорят о его шаперонной активности. Функция шаперонов в клетке заключается в том, что они связываются с поврежденными или вновь синтезированными белками и формируют правильную нативную конформацию; шапероны также доставляют белки в определенные органеллы. Шапероны находят в белках-мишенях гидрофобные участки, открытые у поврежденных белков или открывающиеся у нормальных, зрелых клеточных белков в момент изменения их конформации. Конформационные изменения происходят, например, вследствие воздействия стресс-факторов на клетки. К настоящему времени установлено, что белки семейства БТШ70 являются одними из основных элементов системы контроля за качеством белков, участвуют в работе всех систем жизнеобеспечения клетки и усиливают резистентность клеток к воздействию цитотоксических факторов. Эти данные демонстрируют огромный терапевтический потенциал, заложенный в препаратах на их основе.

После открытия секреции БТШ70 в экстраклеточное пространство и его интернализации нервными клетками резко возрос интерес к экзогенному применению БТШ70 для лечения нейродегенеративных заболеваний, поскольку до этого были серьезные ограничения его использования для усиления протективного потенциала нервных клеток из-за того, что многие нейроны утрачивают способность к экспрессии БТШ70, в том числе и в ответ на стресс. Кроме того, с возрастом работа шаперонного аппарата ухудшается. Таким образом, хотя базальный уровень БТШ70 в нервных клетках сохраняется, способность к его экспрессии в ответ на стресс значительно ослабевает.

На пути широкого применения БТШ70 как в научных исследованиях, так и в клинике имеются серьезные препятствия. Как показали исследования биологическая активность БТШ70 при его экзогенном применении в нервной системе не стабильна. Один и тот же препарат, введенный животным, примерно, в одинаковой дозе индуцирует реакции разной направленности [1, 5, 6]. Причина таких противоречий заключается в различной активности БТШ70, отличающейся от партии к партии. Вопрос стандартизации препарата БТШ70 остается открытым, но крайне важным как для проведения экспериментальных исследований с целью выяснения функциональных свойств БТШ70, так и для фармакологических испытаний.

Поиск аналогов определения нейротропной активности БТШ70 по базе данных Федерального Института Промышленной собственности с 1994 по 2006 гг., не выявил заявок по данной теме.

Аналогом предлагаемого способа является тестирование нейротропных и протективных эффектов, а также ноотропной активностей БТШ70 в условиях экзогенной аппликации белка на переживающие срезы мозга крыс [3, 4, 5].

Согласно этим данным аппликации БТШ70 на срезы в концентрации 0,7 мкг/мл вызывала увеличение амплитуды отдельных компонентов ФП, в частности амплитуда НМДА ВПСП (наиболее чувствительный компонент к действию белка) возрастала на 45% по сравнению с контролем, что было рассмотрено как нейротропный эффект, вызываемый БТШ70 [6]. В условиях аноксического действия на срезы аппликация БТШ70 (0,7 мкг/мл) защищала НМДА ВПСП от разрушающего воздействия длительной 10 мин аноксии [4] и, тем самым, была продемонстрирована протективная активность БТШ70. В последующем была обнаружена ноотропная функция БТШ70, которая проявлялась в облегчении развития фазы индукции амплитуды долговременной посттетанической потенциации (неассоциативная форма научения) и в пролонгации потенцированного состояния, т.е. белок ускорял и усиливал развитие процессов научения. Следовательно, эти данные можно рассматривать как свидетельство наличия ноотропных свойств у БТШ70 [5].

Однако в этих исследованиях не ставилась задача определения активности БТШ70, а лишь тестировались эффекты, которые возникали при аппликации белка на переживающие срезы мозга.

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения биологической, конкретно, нейротропной активности БТШ70 в нервной системе как для стандартизации условий при проведении экспериментальных исследований свойств БТШ70, так и при клинических испытаниях в качестве терапевтического средства для лечения некоторых нейродегенеративных заболеваний.

Предлагаемое изобретение реализуется следующим образом. Из мозга крыс-самцов линии Вистар изготавливаются переживающие тангенциальные срезы толщиной 400-500 мкм специально разработанными инструментами [2]. Срезы помещаются в специальную инкубационную камеру и непрерывно перфузируются искусственной церебральной жидкостью (mM): NaCl – 124.0; KCl – 5.0; CaCl₂ – 2.6; КН₂PO₄ – 1.24; MgSO₄ – 1.2; NaHCO₃ – 3.0; глюкоза – 10.0; трис-HCl – 23.0; со скоростью 2 мл/мин. Раствор насыщается кислородом, температура поддерживается на уровне 37°С, рН – 7.2-7.3, среда и атмосфера над срезами насыщается кислородом.

В срезах регистрируются фокальные потенциалы (ФП) стеклянными микроэлектродами, заполненными 1 М NaCl сопротивлением 1-5 мОм в ответ на одиночные ортодромные электрические импульсы (прямоугольной формы, длительностью 0,1 мс, сила 1-3 В, частота 0,1/с) латерального обонятельного тракта (ЛОТ), который является главным афферентным входом к клеткам структур обонятельной коры. Индифферентный серебряный электрод располагается в камере.

ФП усиливаются (усилитель УБП-2), оцифровываются при помощи аналого-цифрового устройства (МД-32) с частотой квантования 20 кГц и обрабатываются на компьютере (Pentium 4) с помощью специальной программы. ФП являются многокомпонентными по составу и отражают прохождение возбуждающих импульсов в нейрональной сети обонятельной коры мозга. Анализируются изменения амплитуд компонента ФП – N-метил-D-аспартатного (НМДА) рецепторного компонента возбуждающего постсинаптического потенциала (ВПСП). Измерение амплитуд этого компонента производилось от изолинии до пика.

Далее на срезы апплицируют физиологический раствор и измеряют амплитуду НМДА ВПСП, которая принимается за 1 условную единицу (у.е.) и обозначается как контрольная. Затем на срезы апплицируют БТШ70 в концентрации 1 мг/мл. Через 15 мин измеряют амплитуду НМДА ВПСП в контроле и при действии БТШ70. Вычисляют нейротропный индекс – I_N как алгебраическую сумму между значением НМДА ВПСП в контроле и при действии БТШ70, она выражается в у.е.

Вторым этапом определения активности БТШ70 является установление индекса пластичности – I_P. С этой целью в срезах, инкубируемых в физиологическом растворе, измеряют амплитуду НМДА ВПСП, которая является контрольным значением и принимается равным единице у.е. Далее на срез апплицируют БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и тетанизируют его с частотой 100 Гц в течение 30 с, пачками 5 с с интервалом 5 с. Спустя 15 мин после тетанизации измеряют амплитуду НМДА ВПСП, которая является показателем потенциированного состояния в клетках срезов. Вычисляют I_P (у.е.) как алгебраическую разницу между контрольной и потенциированной амплитудами НМДА ВПСП.

Конечным этапом определения активности БТШ70 является определение протективного индекса – I_Pr. В срезах, инкубируемых в физиологическом растворе, измеряют амплитуду НМДА ВПСП, которая является контрольным значением, и принимают равным единице у.е. Далее на срез апплицируют БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и при этом атмосферу в камере со срезом сменой кислорода на азот. Через 15 мин измеряют амплитуду НМДА ВПСП, и полученное значение алгебраически вычитают из контрольной величины, полученный результат – индекс I_Pr (у.е.).

Затем определяют активность БТШ70 по формуле (1)

А=(I_N×I_P×I_Pr)×100%,

где А – активность БТШ70 в %, I_N – нейротропный индекс, у.е.; I_P – индекс пластичности, у.е.; I_Pr – протективный индекс, у.е.

По полученному результату в таблице определяют уровень физиологической активности БТШ70, который по нашим данным делится на три диапазона: низкая, нормальная, высокая.

Низкий уровень активности БТШ70 означает, что белок при тестировании на переживающих срезах не будет проявлять усиления амплитуды НМДА ВПСП, не будет способствовать развитию процессов научения, а также не окажется способным защитить функционирование клеточных механизмов от разрушающего действия длительной (10 мин) аноксии. Кроме того, при тестировании белка с такой величиной активности на целых животных невозможно получить отчетливых эффектов на модификацию поведенческих реакций.

Нормальная активность свидетельствует о том, что БТШ70 будет активировать электрическую активность в срезах, будет способствовать развитию в них процессов научения и памяти, а также будет защищать биоэлектрическую активность от разрушающего аноксического (10 мин) воздействия. При тестировании такого белка на целых животных регистрируется возрастание ориентировочно-двигательной активности при тестировании инъецированных БТШ70 животных в тесте «открытое поле», при этом сокращаются периоды замирания, увеличивается уровень тревожности.

Высокая активность БТШ70 указывает на то, что белок будет значительно активировать электрическую активность в срезах, способствовать пролонгированному развитию в них процессов научения и памяти, а также надежно защищать механизмы биоэлектрической активности клеток и синаптических передач от поражающего длительного аноксического (10 мин) воздействия. При тестировании белка с таким уровнем активности на целых животных регистрируются значительное увеличение ориентировочно-двигательной активности, снижение уровня эмоциональности.

Однако полученные данные нуждаются в концентрационной корректировке использованного БТШ70. По данным некоторых исследователей направленность и выраженность реакций животных при использовании экогенного белка зависит от его концентрации и эффекты, вызываемые им, изменяются на противоположные [1, 5, 6].

С тем, чтобы соотнести активность белка с его концентрацией, были проведены исследования по определению концентрационной зависимости амплитуд НМДА ВПСП в срезах мозга от дозы экзогенно подводимого БТШ70. БТШ70 (был тестирован белок с нормальной активностью) на срезы мозга апплицировался в различных концентрациях. В срезах измерялась амплитуда НМДА ВПСП принятым способом – от изолинии до пика.

Выявлено, что аппликация БТШ70 на срезы в диапазоне концентраций 0,1-3,0 мкг/мл вызывает прогрессивное монотонное увеличение амплитуды НМДА ВПСП. При увеличении концентрации БТШ70 до 3,0-10,0 мкг/мл белок индуцирует резкое снижение амплитуд НМДА ВПСП. Прямолинейный участок изменений амплитуд НМДА ВПСП находится в диапазоне 0,5-3,0 мкг/мл при действии экзогенного БТШ70. Таким образом, этот диапазон концентраций соответствует дозам белка (1-3 мкг/мл), которые применяются в исследованиях на целых животных in vivo и в клинике [1, 5, 6]. Следовательно, определение активности БТШ70 нужно производить при тестировании белка в дозах 1-3 мкг/мл, как это было описано выше в предложенном нами методе.

Таким образом, предлагается способ определения активности БТШ70, который по совокупности отличительных признаков, приводящих к решению новой технической задачи, соответствует критериям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленно применима». Способ апробирован и может использоваться в фармацевтической практике.

Заявленный способ поясняется следующими примерами.

Пример 1

На предварительно приготовленный переживающий срез коры мозга крыс линии Вистар стеклянным микроэлектродом (с сопротивлением 5 мОм) регистрировали ФП, в ответ на раздражение срезов электрическими импульсами прямоугольной формы. В ФП анализировали изменения амплитуд НМДА ВПСП при перфузии срезов в контрольном инкубационном растворе. Средняя величина амплитуд НМДА ВПСП была контрольной и равна 1 условных единиц. Затем на срез апплицировали БТШ70, предварительно полученный в лабораторных условиях (Институт Цитологии РАН), в концентрации 1 мг/мл. Через 15 мин измерили амплитуду НМДА ВПСП, которая составляла 1,16 условных единиц по отношению к контролю. Затем определили алгебраическую разницу амплитуд в контроле и при действии БТШ70, которая равнялась 0,16 условных единиц и соответствовала нейротропному индексу – I_N. Для надежности такие измерения были проведены на 5 срезах. Средняя величина I_N составила 0,21 условных единиц.

На другом предварительно подготовленном срезе перфузируемом в инкубационном растворе была измерена амплитуду НМДА ВПСП, которая была контролем и равна 1 условных единиц. Затем на срез апплицировали БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и тетанизировали его с частотой 100 Гц в течение 30 с, пачками 5 с с интервалом 5 с. Спустя 15 мин после тетанизации измерили амплитуду НМДА ВПСП, которая была равна 1,28 условных единиц по отношению к контролю. Далее определили индекс пластичности I_P как алгебраическую разницу между контрольной и потенциированной амплитудами НМДА ВПСП, она составила 0,28 условных единиц. Для получения статистически значимых величин такие измерения были повторены на 5 срезах. Средняя величина I_P составила 0,3 условных единиц.

На другом срезе было проведено определение протективного индекса – I_Pr. Для этого в срезе, инкубируемых в физиологическом растворе измерили амплитуду НМДА ВПСП, которая явилась контрольным значением и была принята равной единице. Затем на срез апплицировали БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и одновременно с этим заменили атмосферу в камере со срезом с кислорода на азот в течение 10 мин. Через 15 мин была измерена амплитуду НМДА ВПСП, которая была равна – 0,51 условных единиц. Это значение было алгебраически вычтено из контрольной величины, что составило 0.49 условных единиц. Полученный результат является индексом I_Pr. Среднее значение при тестировании на 5 срезах было равно 0,5 условных единиц.

На основании проведенных измерений по формуле (1) была вычислена активность БТШ70: А=(0,21×0,3×0,5)×100%=3,15±0,15%

По таблице полученная величина соответствует нормальной активности БТШ70 и может быть с успехом использована как в экспериментах, так и в клинике.

Пример 2

На предварительно приготовленных 5 переживающих срезах коры мозга крыс линии Вистар стеклянным микроэлектродом (с сопротивлением 5 мОм) последовательно в каждом срезе зарегистрировали ФП, в ответ на раздражение срезов электрическими импульсами прямоугольной формы. В ФП анализировали изменения амплитуд НМДА ВПСП при перфузии срезов контрольным инкубационным раствором. Средняя величина амплитуд НМДА ВПСП в контрольных измерениях была равна 1 условных единиц. Затем на каждый срез отдельно апплицировали БТШ70, полученный из мозга быка, лиофилизированный (Sigma, США, № по каталогу 2004-2005 гг. – Н 9776), в концентрации 1 мг/мл. Через 15 мин в каждом срезе измерили амплитуду НМДА ВПСП, средняя величина которой составляла 1,37 условных единиц. Затем определили алгебраическую разницу амплитуд в контроле и при действии БТШ70, которая равнялась 0,37 условных единиц и соответствовала нейротропному индексу – I_N.

На других 5 предварительно подготовленных срезах перфузируемых в инкубационном растворе в каждом из них была измерена амплитуду НМДА ВПСП, которая была контролем и была равна 1 условных единиц. Затем на каждый срез апплицировали БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и тетанизировали их с частотой 100 Гц в течение 30 с, пачками 5 с с интервалом 5 с. Спустя 15 мин после тетанизации в каждом срезе измерили амплитуду НМДА ВПСП, средняя величина которой для 6 срезов была равна 1,39 условных единиц. Далее определили индекс пластичности I_P как алгебраическую разницу между контрольной и потенциированной амплитудами НМДА ВПСП, она составила 0,39 условных единиц.

На других 5 предварительно подготовленных срезах было проведено определение протективного индекса – I_Pr. Для этого в каждом срезе, инкубируемом в физиологическом растворе, измерили амплитуду НМДА ВПСП, которая явилась контрольным значением и была равна 1 условных единиц. Затем на каждый срез апплицировали БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и одновременно с этим заменяли атмосферу в камере со срезом с кислорода на азот в течение 10 мин. Через 15 мин в каждом срезе была измерена амплитуду НМДА ВПСП, средняя величина которой была равна – 0,38 условных единиц, что составляет индекс I_Pr.

На основании проведенных измерений по формуле (1) была вычислена активность БТШ70: А=(0,37×0,39×0,38)×100%=5,48±0,08%

По таблице полученная величина соответствует высокой активности БТШ70 и может быть с успехом использована как в экспериментах, так и в клинике.

Пример 3

На предварительно приготовленных 5 переживающих срезах коры мозга крыс линии Вистар стеклянным микроэлектродом (с сопротивлением 5 мОм) последовательно в каждом срезе зарегистрировали ФП, в ответ на раздражение срезов электрическими импульсами прямоугольной формы. В ФП анализировали изменения амплитуд НМДА ВПСП при перфузии срезов контрольным инкубационным раствором. Средняя величина амплитуд НМДА ВПСП в контрольных измерениях была равна 1 условных единиц. Затем на каждый срез отдельно апплицировали БТШ70, рекомбинантный, (Sigma, США, № по каталогу 2004-2005 гг. – Н 7283), в концентрации 1 мг/мл. Через 15 мин в каждом срезе измерили амплитуду НМДА ВПСП, средняя величина которой составляла 1,12 условных единиц. Затем определили алгебраическую разницу амплитуд в контроле и при действии БТШ70, которая равнялась 0,12 условных единиц и соответствовала нейротропному индексу – I_N.

На других 5 предварительно подготовленных срезах перфузируемых в инкубационном растворе в каждом из них была измерена амплитуду НМДА ВПСП, которая была контролем и была равна 1 условных единиц. Затем на каждый срез апплицировали БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и тетанизировали их с частотой 100 Гц в течение 30 с, пачками 5 с с интервалом 5 с.Спустя 15 мин после тетанизации в каждом срезе измерили амплитуду НМДА ВПСП, средняя величина которой для 6 срезов была равна 1,1 условных единиц. Далее определили индекс пластичности I_P как алгебраическую разницу между контрольной и потенциированной амплитудами НМДА ВПСП, она составила 0,1 условных единиц.

На других 5 предварительно подготовленных срезах было проведено определение протективного индекса – I_Pr. Для этого в каждом срезе, инкубируемых в физиологическом растворе измерили амплитуду НМДА ВПСП, которая явилась контрольным значением и была равна 1 условных единиц. Затем на каждый срез апплицировали БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и одновременно с этим заменяли атмосферу в камере со срезом с кислорода на азот в течение 10 мин. Через 15 мин в каждом срезе была измерена амплитуду НМДА ВПСП, средняя величина которой была равна – 0,8 условных единиц, что составляет индекс I_Pr.

На основании проведенных измерений по формуле (1) была вычислена активность БТШ70: А=(0,12×0,1×0,8)×100%=0,96±0,14%

По таблице полученная величина соответствует низкой активности БТШ70 и не может быть использована как в экспериментах, так и в клинике.

Изобретение позволяет стандартизировать условия проведения экспериментов и клинических испытаний с использованием БТШ70, исключить возможные ошибки в эффектах, вызываемых белком при его применении с разными уровнями активности.

Литература

^th Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry “Stress and Behavior” (St. Petersburg, Russia, 2004). Журн. «Психофармакология и биологическая наркология», 2004, т.4, №2-3, с.700-701.

Формула изобретения

Способ определения активности белка теплового шока (БТШ70) с молекулярной массой 70 кДа, включающий подготовку белка, переживающих срезов нервной ткани мозга, инкубационной среды для срезов, измерение и сопоставление параметров биоэлектрической активности исходных и после тестирующих воздействий и математическую обработку результатов сопоставления, отличающийся тем, что у приготовленных срезов регистрируют исходные параметры амплитуды N-метил-D-аспартатного возбуждающего постсинаптического потенциала (НМДА ВПСП), для определения амплитуды НМДА ВПСП срезы стимулируют электрическими импульсами прямоугольной формы длительностью 0,1 мс, интенсивностью 10 В, с частотой 1 импульс в минуту, далее апплицируют (БТШ70) на все срезы в концентрации 1 мкг/мл, затем срезы одной группы тетанизируют электрическими импульсами с частотой 100/с, длительностью 30 с, срезы другой группы подвергают аноксическому воздействию путем замены кислородной атмосферы на азот в течение 10 мин, у всех срезов измеряют амплитуду НМДА ВПСП после воздействий, и сопоставляя параметры амплитуды НМДА ВПСП

до и после аппликации БТШ70 определяют нейротропный индекс I_N,

до и после электрической тетанизации определяют индекс пластичности I_P,

до и после аноксии определяют протективный индекс I_Pr, затем определяют активность белка по формуле

А=(I_N·I_P·I_Pr)·100%,

где А – активность БТШ70 в %, I_N – нейротропный индекс, у.е.;

I_P – индекс пластичности, у.е.; I_Pr – протективный индекс, у.е.,

при этом показатели активности БТШ70 (А, %) в пределах 0,41-1,7±0,15 свидетельствуют о низкой активности, в пределах 2,06-5,2±0,11 – о нормальной активности, а в пределах 5,3-5,6±0,09 – о высокой активности.