|
|
(21), (22) Заявка: 2005100758/15, 11.06.2003
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
11.06.2003
(30) Конвенционный приоритет:
11.06.2002 EP 02012919.3
(43) Дата публикации заявки: 20.01.2006
(46) Опубликовано: 20.09.2008
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
WO 0240997 A, 23.05.2002. GB 2349463 A, 01.11.2000. REECE JC et al. Mapping the major human Т helper epitopes of tetanus toxin. The emerging picture., J Immunol. 1993 Dec 1; 151(11):6175-84. PMID: 7504014 [PubMed – indexed for MEDLINE]. WARMERDAM PA et al, Staphylokinase-specific cell-mediated immunity in humans., J Immunol. 2002 Jan 1;
(85) Дата перевода заявки PCT на национальную фазу:
11.01.2005
(86) Заявка PCT:
EP 03/06110 (11.06.2003)
(87) Публикация PCT:
WO 03/104803 (18.12.2003)
Адрес для переписки:
101000, Москва, М.Златоустинский пер., 10, кв.15, “ЕВРОМАРКПАТ”, пат.пов. И.А.Веселицкой, рег. № 11
|
(72) Автор(ы):
БЕЙКЕР Маттью (GB),
КАРР Франсис Дж. (GB),
КАРТЕР Грэм (GB)
(73) Патентообладатель(и):
МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ (DE)
|
(54) СПОСОБ КАРТИРОВАНИЯ И УСТРАНЕНИЯ ЭПИТОПОВ Т-КЛЕТОК
(57) Реферат:
Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен способ конструирования карты эпитопов Т-клеток для исследуемого белка или его фрагмента при использовании мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Изобретение также касается идентификации эпитопов Т-клеток в терапевтических белках. Кроме того, изобретение относится к комбинированному подходу использования картирования эпитопов в соответствии с идентификацией лигандов класса II МНС, которые выявлены с помощью указанного способа картирования, и к конструированию аналогичной последовательности, которая содержит уменьшенное количество таких лигандов. Изобретение обеспечивает способы скрининга для идентификации детерминант и эпитопов молекул белка, которые способны вызвать иммунный ответ. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.
(56) (продолжение):
CLASS=”b560m”168(1):155-61, PMID: 11751958 [PubMed – indexed for MEDLINE]. РОЙТ А. и др., Иммунология, изд. «Мир», 2000, стр.149-167. STICKLER M.M. et al, CD4+T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells., J Immunother (1997). 2000 Nov-Dec; 23(6):654-60. PMID: 11186153 [PubMed – indexed for MEDLINE].
Текст описания приведен в факсимильном виде.                                                    
Формула изобретения
1. Способ конструирования карты эпитопов Т-клеток для исследуемого белка или его фрагмента при использовании мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), который включает следующие этапы:
(i) примирование антигена in vitro при использовании цельного исследуемого белка или синтетических пептидов, которые являются типичными и получены из аминокислотной последовательности исследуемого белка или его фрагментов, путем инкубации и культивирования синтетических пептидов с Т-клетками, полученными из РВМС;
(ii) обработку и культивирование примированных Т-клеток с цитокином;
(iii) прибавление примированных Т-клеток к аутологическим облученным РВМС и проведение нового примирования и культивирования с указанными синтетическими антигенами, и (iv) измерение ответа Т-клеток в анализе пролиферации Т-клеток при использовании предварительно выбранной прописи анализа зависимости от времени.
2. Способ по п.1, в котором РВМС, содержащие Т-клетки, были выделены из множества здоровых особей, которые ранее не были подвергнуты воздействию при использовании исследуемого белка, его фрагмента или пептидного антигена.
3. Способ по п.2, в котором РВМС были получены из пула особей доноров, которые имеют достаточное иммунологическое разнообразие, характеризующееся более чем 90% набором класса II МНС.
4. Способ по п.1, в котором РВМС, содержащие Т-клетки, были получены от пациентов, у которых существует установленный иммунный ответ на исследуемый белок или его фрагмент.
5. Способ по п.2, в котором индивидуальная особь представляет собой человека, а исследуемый белок является белком человека.
6. Способ по п.1, в котором полную длину исследуемого белка подвергают сканированию на синтетические перекрывающиеся пептиды предварительно определенного одинакового размера, который составляет, по крайней мере, три аминокислоты из выбранного участка.
7. Способ по п.6, в котором указанные синтетические перекрывающиеся пептиды содержат 9-15 аминокислотных остатков.
8. Способ по п.7, в котором указанные синтетические пептиды содержат 15 аминокислотных остатков.
9. Способ по п.1 или 2, в котором цитокин представляет собой IL-2.
10. Способ по п.1 или 2, в котором анализ в зависимости от времени осуществляют следующим образом:
1) размораживали одну пробирку РВМС, полученную от каждого донора,
2) ресуспендировали клетки при концентрации 2-4·106 клеток/мл,
3) вносили 1 мл в 3 ячейки планшета на 24 ячейки, что обеспечивает конечную концентрацию 2-4·106 РВМС/ячейка,
4) готовили маточные растворы антигена с концентрацией 100 мкг/мл для белков и 2-10 мкМ для пептидов, прибавляли 1 мл антигена к каждой ячейке для получения конечной концентрации 10-50 мкг/мл белка или 1-5 мкМ пептида,
5) инкубировали 5 дней,
6) с помощью пипетки ресуспендировали клетки в 2 мл культуры и в каждом случае удаляли 100 мкл клеток и переносили в ячейку планшета на 96 ячеек с круглым дном, повторяли эту процедуру трижды для каждых условий культивирования (удаляли общее количество 300 мкл для каждого из условий культивирования в определенный момент времени),
7) к каждой ячейке планшета на 96 ячеек прибавляли 1 мкКи/ячейка 3Н-[Thy] в 100 мкл AIM V,
8) инкубировали в течение ночи и проводили сбор,
9) повторяли этапы 6-8 на 6,7 и 8 дни (можно включать день 9, если это необходимо),
10) определяли значения S1 и строили диаграммы значений S1 относительно времени для каждого антигена.
11. Способ по п.1 или 2, в котором исследуемый белок представляет собой терапевтический белок.
12. Способ анализа активации Т-клеток, включающий осуществление способа по любому из пп.1-11.
13. Применение анализа активации Т-клеток для определения слабо иммуногенных белков, полипептидов или пептидов.
14. Способ получения иммуногенно модифицированного биологического исследуемого белка из исходной молекулы, обладающего такой же биологической активностью, при этом модифицированная молекула имеет аминокислотную последовательность, отличную от таковой для указанной исходной молекулы, и демонстрирует сниженную иммуногенность по сравнению с исходной молекулой, когда подвергается воздействию иммунной системы данного вида; при этом указанный способ включает (i) определение аминокислотной последовательности исходного белка или его части; (ii) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток, (iii) конструирование новых вариантов последовательности путем изменения, по крайней мере, одного аминокислотного остатка в пределах исходно идентифицированных последовательностей эпитопа Т-клетки, при этом указанные варианты являются модифицированными таким образом, что существенно снижают или устраняют активность ряда последовательностей эпитопа Т-клетки и/или ряд аллотипов МНС, способных связывать пептиды, имеющие происхождение от указанной биологической молекулы, как определено путем связывания пептидов с МНС и связывания комплексов пептид-МНС с Т-клетками, соответственно, (iv) конструирование таких вариантов последовательности с помощью техники рекомбинантных ДНК и тестирование указанных вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желательными свойствами, и (v) необязательное повторение этапов (ii)-(iv), который отличается тем, что идентификация последовательностей эпитопов Т-клеток в соответствии с этапом (ii) включает способ по любому из пп.1-11.
15. Способ по п.14, в котором этап идентификации (ii) дополнительно включает использование вычислительных способов для подсчета значения связывания молекулы класса II МНС для каждого указанного сегмента синтетического исследуемого пептида путем суммирования заданных значений для каждой гидрофобной боковой цепи аминокислотных остатков, которые присутствуют в указанном исследуемом сегменте аминокислотных остатков, и выбор, по крайней мере, одного из указанных синтетических пептидных сегментов для модификации.
16. Способ по п.15, в котором выбранный синтетический пептид имеет индекс иммуногенной стимуляции ((SI), который составляет более чем 2,0, при этом значение SI получают путем деления значения пролиферации Т-клеток, измеренного для выбранного пептида, на значение, измеренное в клетках, которые не подвергают контакту с пептидом.
17. Способ по п.14 или 15, в котором модифицированный исследуемый белок имеет индекс иммуногенной стимуляции (SI), меньший, чем 1,8.
РИСУНКИ
|
|
