Патент на изобретение №2334234

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний. Для осуществления способа эритроциты крови исследуют методом дифференциальной сканирующей калориметрии в режиме программируемого линейного нагрева. При этом злокачественные новообразования выявляют на основании профиля калориметрической кривой процесса тепловой денатурации мембранных белков полос 2.1, 4.1 и 4.2. Основными критериями, указывающими на образование в организме злокачественных опухолей, являются: S-образная форма калориметрической кривой, чрезвычайно низкая величина энтальпии термоперехода, снижение теплоемкости мембраны эритроцита. Предлагаемый способ позволяет оперативно (в течение 30-40 минут) выявлять злокачественные новообразования в 90% случаев даже при отсутствии видимых изменений в морфологии клеток, т.е. на ранней стадии заболевания. Использование способа обеспечивает повышение надежности диагностики онкологических заболеваний и эффективный мониторинг состояния здоровья больного в процессе лечения. 3 ил., 4 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний и мониторинга лечения.

В настоящее время для диагностики онкологических заболеваний наиболее часто используют методы и подходы, основанные на изучении функционального и морфологического состояния клеток крови и костного мозга [Зайчикова С.Г., Сухарев Д.Н., Киселевский М.В., Доненко Ф.В., Аманджолов Б.С., заявка РФ №2004121099, кл. G01N 33/49, 2005 г.; Гордецов А.С., Игнатьев А.А., Волкова С.А., патент РФ №2210772, кл. G01N 33/483, 2003 г.]. Однако возможность обнаружения морфологически измененной клетки крови на начальной стадии развития болезни статистически маловероятна, поскольку нарушения регуляторных процессов в организме в этом случае носят слабовыраженный или локальный характер.

Для раннего выявления злокачественных опухолей и их метастазов предложено применять методы определения опухолевых маркеров – веществ белковой природы, присутствие которых в биологических жидкостях организма (кровь, моча, слюна и т.д.) может свидетельствовать о наличии рака [Келльнер Р., Мацку 3., Зелигер Б., Лихтенфельс Р., международный патент WO №02/08207 (17.10.2002), заявка РФ №2003130645, кл. G01N 33/48, 2005 г.; Алонсо Лебреро М.А., Марасуэла Аспирос М., Асеведо Барбера А.Л., международный патент WO №03/07694 (18.09.2003), заявка РФ №2004129773, кл. С01N 33/68, 2005 г.]. Данный способ диагностики онкологического заболевания должен отвечать следующим условиям:

1. Злокачественная опухоль должна вырасти до определенного минимального размера (так называемой критической массы), чтобы “наработать” количество опухолевого маркера, достаточное для определения современными методами анализа.

2. Маркер должен обладать высокой специфичностью и чувствительностью в отношении определенного вида опухоли.

3. Повышенный уровень маркеров должен обнаруживаться уже при малых размерах опухоли.

Однако большинство известных в настоящее время опухолевых маркеров не отвечает этим критериям. Например, при некоторых патологиях, не имеющих отношения к онкологическому заболеванию, также может наблюдаться повышение уровня изучаемых маркеров, что значительно затрудняет диагностику данного заболевания.

Наиболее близким по технической сущности является способ ранней диагностики онкологических заболеваний различной этиологии, основанный на исследовании микровязкости мембран клеток крови с помощью флуоресцентных зондов [Горошинская И.А., Голотина Л.Ю., Горло Е.И., Ровда Т.А., Бордюшков Ю.Н. Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных. – Вопросы Медицинской химии, №1,1985, с.15-20; Терещенко С.Ю., Прахин Е.И., Бабушкин В.А., патент РФ №2187112, кл. С01N 33/483, 2002 г.]. Однако в работах, посвященных данному способу диагностики, отсутствуют сведения о его специфичности для выявления структурных изменений клеток, характерных именно для опухолевого процесса. Кроме того, введение зондов в клеточную мембрану может повлиять на ее структурно-функциональное состоянии, что отразится на достоверности диагностики.

Общим недостатком перечисленных способов диагностики злокачественных опухолей является то, что все они позволяют обнаруживать заболевание не более чем в 60% случаев.

Задачей настоящего изобретения является повышение надежности диагностики онкологических заболеваний на различных стадиях развития злокачественной опухоли, обеспечение эффективного мониторинга состояния здоровья больного в процессе лечения, упрощение процедуры исследования и сокращение его сроков.

Технический результат достигается тем, что диагностика и мониторинг онкологических заболеваний осуществляются способом, основанном на определении методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) термодинамических характеристик тепловой денатурации мембранных белков эритроцитов (МБЭ) крови. Предлагаемый способ позволяет оперативно выявлять злокачественные новообразования не менее чем в 90% случаев, причем даже тогда, когда стрессовая реакция организма на заболевание отсутствует и видимых нарушений в морфологии самих клеток еще не наблюдается, т.е. на ранних стадиях развития онкологического заболевания. Благодаря тому что диагностическое исследование с помощью метода ДСК проводится в узком диапазоне температур (от 52±1°С до 58±1°С), на получение конечного результата анализа затрачивается всего 30-40 минут, что в 2-3 раза короче по сравнению с другими известными способами диагностики онкологических заболеваний.

Объектом анализа, на основании которого делают заключение о наличии онкологического заболевания, является калориметрическая кривая тепловой денатурации МБЭ. В случае онкологического заболевания коренным образом меняются термодинамические характеристики тепловой денатурации МБЭ полос 2.1, 4.1 и 4.2 – энтальпия термоперехода (Н) и теплоемкость мембраны эритроцита (С_р), регистрируемые прибором в области температур от 52±1°С до 58±1°С. Одновременно меняется профиль соответствующего участка калориметрической кривой. На фиг.1 представлена типичная калориметрическая кривая тепловой денатурации МБЭ здорового человека, полученная с помощью сканирующего микрокалориметра microDSCIII (фирмы Setaram, Франция) в режиме линейного нагрева 0,4°С/мин для суспензии интактных эритроцитов крови человека в 310 мосм натрий-фосфатном буфере рН 7,4. Из фиг.1 видно, что в отсутствие онкологического заболевания на калориметрической кривой в изучаемом интервале температур (50-65°) наблюдается серия из трех V-образных термопереходов разной интенсивности при температурах 51°С, 56°С и 61°С, что, согласно литературным данным, относится к тепловой денатурации спектрина (Т=51°С), белков полос 2.1,4.1, 4.2 (Т=56°С) и белка полосы 3 (Т=61°С).

При онкологическом заболевании независимо от его этиологии кардинально меняется профиль калориметрической кривой в области температур 50-58°С, а именно: полностью подавляется термопереход спектрина, а переход, отвечающий тепловой денатурации белков полос 2.1, 4.1 и 4.2, из V-образного преобразуется в S-образный (фиг.2 для МБЭ крови больного гемобластозом и фиг.3 – для МБЭ крови человека с онкологическим заболеванием желудочно-кишечного тракта), по форме напоминая зеркальное отражение так называемого эффекта стеклования, характеризующегося нулевыми показателями Н и значительными изменениями теплоемкости системы (в данном случае в диапазоне температур 52-58°С прибор регистрирует снижение теплоемкости суспензии эритроцитов в среднем на 11 мДж/г·К). Что же касается белка полосы 3, то он, судя по неизменности профиля и величины теплового эффекта его денатурации на калориметрической кривой (фиг.1-3), оказался малочувствительным к нарушениям регуляторных процессов в организме человека, обусловленным развитием злокачественной опухоли. Из этого следует, что онкологическое заболевание не обязательно должно сопровождаться видимыми изменениями в морфологии эритроцитов крови, поскольку инициируемые им перестройки в мембране клетки носят локальный характер, т.е. затрагивают только те липид-белковые структуры, где расположены спектрин и белки полос 2.1, 4.1 и 4.2. Принимая во внимание тот факт, что состояние спектрина в мембране эритроцита зависит от целого ряда факторов, в том числе патологий, не имеющих отношения к онкологическому заболеванию, в предлагаемом способе диагностики основными критериями, указывающими на развитие в организме злокачественных опухолей, являются термодинамические характеристики тепловой денатурации белков полос 2.1, 4.1 и 4.2, а именно:

– S – образная форма калориметрической кривой тепловой денатурации МБЭ полос 2.1, 4.1 и 4.2,

– чрезвычайно малая (приближающаяся к нулевому значению) величина энтальпии (Н) указанного термоперехода,

– снижение теплоемкости мембраны эритроцита (С_р) в интервале температур 52(±1)-58(±1)°С в среднем на 11 мДж/г·К (в пересчете на 1 грамм суспензии эритроцитов).

Способ осуществляется следующим образом. У пациента берут кровь в количестве 1,0 мл из вены и помещают в стерильную силиконовую пробирку. Затем по стандартной методике готовят образец суспензии эритроцитов в изотоническом 310 мосм натрий-фосфатном буфере рН 7,4. Образец в количестве 0,5 мл исследуют методом ДСК в режиме линейного нагрева 0,3-0,4°С/мин с целью определения термодинамических характеристик тепловой денатурации мембранных белков эритроцитов (МБЭ). В качестве измерительного прибора используют сканирующий микрокалориметр microDSCIII (фирма Setaram, Франция) с пороговой чувствительностью 0,02 мкВт. На исследование берут только свежеприготовленный образцы суспензий эритроцитов.

С помощью разработанного способа проведено исследование образцов эритроцитов крови 88 человек. В исследуемые группы вошли больные гемобластозами (44 человека, из них на второй стадии заболевания 16 человек), раком прямой кишки (18 человек, из них на второй стадии заболевания 4 человека), ишемической болезнью сердца (3 человека) и хроническим пиелонефритом в стадии обострения (3 человека), а также 20 практически здоровых лиц (контрольная группа). Полученные результаты представлены в табл.1.

Приложение к табл.1:

Показатель А (профиль калориметрической кривой):

– A₁ – кривая имеет V-образную форму,

– А₂ – промежуточный вид кривой между V- и S-образной формами;

– А₃ – кривая имеет S-образную форму.

Показатель Б (энтальпия термоперехода Н):

– Б₁ – Н=33,4±11,9 мДж/г.

– Б₂ – 1<Н<33,4 (±11,9) мДж/г,

– Б₃ – 0H<1 мДж/г;

Показатель В (изменение теплоемкости С_р):

– B₁ – [С_р]1 мДж/г·К,

– В₂ – 1<-С_р7 мДж/г·К,

– В₃ – –С_р>7 мДж/г·К (в среднем 11 мДж/г·К).

Как видно из данных, приведенных в таблице 1, по меньшей мере у 90% обследованных онкологических больных имеют место изменения как в профиле калориметрической кривой тепловой денатурации МБЭ полос 2.1, 4.1 и 4.2, так и в термодинамических характеристиках, описывающих этот процесс: S-образная форма калориметрической кривой (показатель А₃). Н0 (показатель Б₃), –С_р>7 мДж/г·К (показатель В₃).

Если у онкологических больных меняются все три показателя, то у больных двух других изученных групп меняется только один – снижается величина энтальпии термоперехода: в 3-4 раза при ишемической болезни сердца и в 2-3 раза при хроническом пиелонефрите в стадии обострения (см. табл.2)

Таблица 2 Усредненные термодинамические характеристики тепловой денатурации МБЭ полос 2.1. 4.1 и 4.2 изученных групп доноров
Исследуемые группы	Н, мДж/г	Ср, мДж/г·К
Здоровые люди	33,4±11.9	[Ср]1
Больные с диагнозами гемобластозы	0,9±2,7	-10,7±3.2
Больные с диагнозом рак прямой кишки	0,8±2,3	-10,6±2,0
Больные с диагнозом ишемическая болезнь сердца	7,2±0,8	[Ср]1
Больные с диагнозом хронический пиелонефрит в стадии обострения	13,7±2,4	[Ср]1

Из данных табл.2 видно, что наличие ишемической болезни сердца и пиелонефрита, которые часто сопровождают онкологическое заболевание, не оказывает существенного влияния на результаты диагностики.

Пример 1. Больной (мужчина в возрасте 34 года) с диагнозом лимфогранулематоз третьей стадии. Методом ДСК были исследованы образцы его крови соответственно до и после проведения курса интенсивной химиотерапии. Установлено, что в результате лечения произошло частичное восстановление указанного термоперехода (см. табл.3). Это отражает наличие положительной динамики изменения физиологических параметров организма и, следовательно, начало периода ремиссии больного.

Таблица 3 Термодинамические характеристики тепловой денатурации МБЭ полос 2.1, 4.1 и 4.2 онкогематологического больного с диагнозом лимфогранулематоз третьей стадии
Время проведения исследования	Характеристики термоперехода тепловой денатурации мембранных белков эритроцита полос 2.1, 4.1 и 4.2
	Профиль калориметрической кривой	Н, мДж/г	Ср, мДж/г·К
До курса интенсивной химиотерапии	S-образная форма (показатель А3)	0 (показатель Б3)	-11,3 (показатель В3)
Сразу после проведения курса интенсивной химиотерапии	Промежуточный между V- и S-формами (показатель А2)	9,7 (показатель Б2)	-7,4 (показатель В3)

Пример 2. Онкологические больные: мужчина в возрасте 48 лет и две женщины 34 и 66 лет с диагнозом рак прямой кишки соответственно второй, третьей и четвертой стадий. Методом ДСК исследованы образцы крови этих пациентов до проведения хирургических операций по удалению злокачественных опухолей и через 2 недели после операции (см. табл.4). Установлено, что в результате лечения у двух пациентов (мужчины 48 лет и женщины 34 лет) имела место положительная динамика изменения физиологических параметров организма, о чем свидетельствовало частичное восстановление изучаемого термоперехода, тогда как у третьего пациента (женщины 66 лет) такая динамика отсутствовала (впоследствии эта больная вынуждена была пройти повторный курс лечения).

Таблица 4 Термодинамические характеристики тепловой денатурации МБЭ полос 2.1, 4.1 и 4.2 онкологических больных с диагнозом рак прямой кишки
Пациент	Характеристики термоперехода тепловой денатурации мембранных белков эритроцита полос 2.1, 4.1 и 4.2
	Непосредственно перед операцией			Через 2 недели после операции
	Профиль кривой ДСК	Н, мДж/г	Ср, мДж/г·К	Профиль кривой ДСК	Н, мДж/г	Ср, мДж/г·К
Мужчина (48 лет, вторая стадия заболевания)	S-образная форма (показатель А3)	0 (показатель Б3)	-11,1 (показатель В3)	Промежуточный между V- и S-формами (показатель А2)	16,8 (показатель Б2)	-2,2 (показатель В2)
Женщина (34 года, третья стадия заболевания)	S-образная форма (показатель А3)	0 (показатель Б3)	-12,0 (показатель В3)	Промежуточный между V- и S-формами (показатель А2)	11,2 (показатель Б2)	-4,5 (показатель В2)
Женщина (66 лет, четвертая стадия заболевания)	S-образная форма (показатель А3)	0 (показатель Б3)	-10,4 (показатель В3)	S-образная форма (показатель А3)	0 (показатель Б3)	-10,6 (показатель В3)

Таким образом, предлагаемый способ позволяет не только оперативно (в течение 30-40 минут) диагностировать онкологические заболевания, но и проводить мониторинг состояния здоровья онкологического больного на протяжении всего курса лечения. Его основным преимуществом перед другими современными методами диагностики онкологических заболеваний является способность выявлять злокачественные новообразования не менее чем в 90% случаев даже при отсутствии видимых нарушении в морфологии изучаемых клеток, т.е. на начальной стадии заболевания. Простота, наглядность и высокая эффективность предлагаемого способа диагностики позволяют рассчитывать на его широкое применение в медицинской практике.

Формула изобретения

Способ диагностики онкологических заболеваний путем исследования эритроцитов крови, отличающийся тем, что эритроциты исследуют методом дифференциальной сканирующей калориметрии в режиме программируемого линейного нагрева, злокачественные новообразования выявляют на основании профиля калориметрической кривой процесса тепловой денатурации мембранных белков полос 2.1, 4.1 и 4.2 и описывающих этот процесс термодинамических характеристик в интервале температур 52(±1)-58(±1)°C, a именно по S-образной форме калориметрической кривой тепловой денатурации МБЭ полос 2.1, 4.1 и 4.2, чрезвычайно малой (приближающейся к нулевому значению) величине энтальпии (Н) указанного термоперехода и снижению теплоемкости мембраны эритроцита (С_р) в среднем на 11 мДж/г·К (в пересчете на 1 г суспензии эритроцитов), при этом частичное восстановление указанных характеристик термоперехода в процессе лечения отражает наличие положительной динамики изменения физиологических параметров организма.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.03.2009

Извещение опубликовано: 27.06.2010 БИ: 18/2010