Патент на изобретение №2334233

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДОВ ПРИ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к акушерству и предназначено для прогнозирования преждевременных родов. Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции включает исследование цервикального канала, при этом исследуют эпителиальные клетки слизистой оболочки, в которых с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют уровень экспрессии гена Toll-подобного рецептора 2 (TLR2), и при его увеличении более чем в пять раз по сравнению с его уровнем, установленным при нормально протекающей беременности, прогнозируют преждевременные роды. Изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования за счет использования в качестве количественного показателя экспрессии гена Toll-подобного рецептора, определяющего каскад биохимических реакций, опосредованных повышенной выработкой цитокинов и соответственно простогландинов, что обуславливает гипертонус миометрия. 1 ил.

Настоящее изобретение относится к акушерству и, в частности, касается прогнозирования преждевременных родов и, соответственно, ведения беременности.

Доказано, что инфекция является частой причиной прерывания беременности. В настоящее время среди причин невынашивания беременности доминируют инфекции, передаваемые половым путем и иммунные нарушения в организме женщины (Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. Москва, Триада-Х, 2000, с.50).

Известен способ прогнозирования преждевременных родов путем определения уровня провоспалительного цитокина ИЛ-6 в слизи цервикального канала на сроках 28-35 недель (Тетруашвили Н.К., Сухих Г.Т. Роль цитокинов в невынашивании беременности. Материалы V Российского форума «Мать и дитя», Москва, 2003, с.231-232). Однако этот способ сложен в осуществлении: методически трудно определять цитокины в слизи, помимо этого цитокины могут быть частично инактивированы антителами, что снижает информативность способа. Этот способ принят за ближайший аналог.

В последние годы отводится ведущая роль системе врожденного иммунитета при физиологически протекающей беременности и ее патологии. К сигнальным рецепторам врожденного иммунитета относятся Toll-подобные рецепторы (TLR), которые представляют собой семейство сигнальных молекул, распознающих консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы (Abrahams Vikki M. Toll-like receptors in the cycling reproductive tract and during pregnancy. Current Woman,s Health Reviews, 2005, 1, p.37).

Известна экспрессия генов Toll-подобных рецепторов в эпителии эндометрия и эпителиальных клетках нижних отделов репродуктивной системы. Показана корреляция уровня экспрессии TLR с различными патологиями при беременности такими, как задержка внутриутробного роста плода, эклампсия (Fazeli А., Bruce С., Anumba D.O. Characterization of toll-like receptors in the female reproductive tract in humans. Human Reproduction? Vol.20, 5, 2005, p.1374).

Нами была поставлена задача поиска маркеров прогнозирования преждевременных родов, связанных с факторами врожденного иммунитета и с TLR при патологии беременности. Наиболее информативным методом определения экспрессии генов TLR является полимеразная цепная реакция, в качестве объекта исследования можно использовать клетки слизистой цервикального канала, легко доступные для исследования.

Задача изобретения – прогнозирование преждевременных родов для выработки тактики ведения беременности.

Техническим результатом предлагаемого является повышение точности прогнозирования с использованием количественного критерия, определяющего каскад биохимических реакций, опосредованных повышенной выработкой цитокинов и соответственно простагландинов, что обуславливает гипертонус миометрия. Количественный результат достигается за счет использования в качестве количественного показателя экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала.

Взяты эпителиальные клетки цервикального канала от больных с урогенитальной инфекцией и здоровых женщин на базе роддома г. Москвы № 8, кафедра акушерства и гинекологии лечебного факультета Российского Государственного Медицинского Университета.

В настоящем исследовании было обследовано 56 беременных женщин: группа женщин с физиологически протекающей беременностью составляла 18 человек, группа с патологией беременности на сроках 28-35 недель – 38 человек. Процент преждевременных родов в группе здоровых беременных составил не более 1%, в то время как в группе женщин с патологией беременности он составил 70%. При изучении показателя уровня экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала беременных женщин были получены следующие результаты. Была выявлена корреляция между повышением копий кДНК, отражающее повышение уровня экспрессии гена TLR2 и процентом преждевременных родов (Фиг.1). К примеру, в группе женщин с нормально протекающей беременностью практически не наблюдалось преждевременных родов и уровень экспрессии гена TLR2 был сравнительно невысок (средний показатель составил 213796±1052,5 копий кДНК на 1000000 копий кДНК -актина, р0,05). При преждевременных родах показатель уровня экспрессии гена TLR2 возрастал более чем в 5 раз и средний показатель составил 1151784±63591 копий кДНК на 1000000 копий кДНК -актина, р<0,05. Увеличение экспрессии TLR2 с большой степенью вероятности приводит к преждевременным родам за счет гиперактивации гуморальных факторов врожденного иммунитета (провоспалительных цитокинов). На основании этих данных показатель экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала был нами обоснованно выбран для прогнозирования преждевременных родов.

В результате данной работы выявлены параметры, которые оказались весьма показательными и пригодными для клинических целей. Способ был разработан на основании длительного наблюдения.

Заявленный способ поясняется на следующих конкретных примерах его осуществления. Пример № 1.

Беременная Г., 26 лет с диагнозом: 1 своевременные роды. Гестационные отеки. Угроза разрыва ригидной промежности. Эпизиотомия. Осмотр родовых путей. Эпизиоррафия.

Пациентка состояла на учете с малого срока беременности (с 3 недель), условия жизни – средние, профессия – бухгалтер. Беременность протекала без осложнений. В третьем триместре отмечала отечность голеней. АД во время беременности в пределах нормы, общие анализы мочи – показатели в пределах нормы. Из соматических заболеваний в анамнезе – в детстве хронический пиелонефрит, снята с учета в подростковом периоде. Менструальная функция не нарушена: с 14 лет, по 5 дней, через 25 дней, цикл регулярный. Данная беременность первая, наступила спонтанно. Рост 162 см, вес 70 кг (до беременности 60 кг). Группа крови вторая, резус – положительная. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики – отрицательно. Родовая деятельность развивалась самостоятельно, роды протекали без родовозбуждения. В течение родов проводилось обезболивание промедолом внутримышечно. Общая продолжительность родов составила 7 ч 10 мин, без вод 6 ч 30 мин (характер околоплодных вод – светлые). Ребенок родился живой, доношенный, пол – мужской, 3950 г, 52 см. Оценка по шкале Апгар на первой минуте 8 баллов, на второй минуте 9 баллов. Мать и ребенок выписаны одновременно на 3 сутки после родов.

Для изучения экспрессии гена TLR2 была использована следующая методика, которая состояла из нескольких этапов: получение клеток цервикального канала, выделение из полученных клеток рибонуклеиновой кислоты (РНК), синтез на матрице РНК копии дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Херингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Москва, Мир, 1999).

Клетки слизистой цервикального канала берут общепринятым способом гинекологическим ершиком и отмываются от слизи культуральной средой Игла с помощью центрифугирования (1500 об/мин, 10 мин). Осадок, содержащий клетки, разбавляют культуральной средой Игла объемом 100 мкл и используют в работе.

К полученным суспензиям добавляют равный объем лизирующего гуанидинтиоционатного буфера (4М гуанидинтиоционат (ДиаМ, РФ), 0,25 mМ цитрат Na pH 7 (Sigma, США), 0,5% лаурилсаркозин (Serva, США), 0,1М 2-меркаптоэтанол (Merck, ФРГ). Лизат, полученный через 15 минут инкубации при комнатной температуре, смешивают с 14 мкл AcONa 3М, рН 5,0 (Реахим, РФ), затем добавляют 1/2 общего объема фенола (рН 5,2) и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее в пробирку с образцом добавляют 1/3 общего объема хлороформа и 20 мкл ацетата Na, встряхивают в течение 5 мин и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 10 мин. Водную фазу отбирают в пробирку с 140 мкл изопропилового спирта и проводят инкубация при температуре -70°С в течение 4-х часов. Далее пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Осадок промывают 200 мкл 80% этилового спирта, растворяют в 20 мкл дистиллированной (без РНК) воды и хранят при -70°С.

Количество полученной РНК оценивают с помощью электрофоретического разделения в 0,8% агарозном геле в присутствии маркеров с известной молекулярной массой (0,1-0,5 мкг).

В реакции обратной транскрипции используют 0,2 мкг РНК. Реакционная смесь содержит dNTP в концентрации 2,5 mM каждого нуклеотида (СибЭнзим, РФ), 10 н молей random гексамеров (Синтол, РФ), 10 н молей TLR2-специфического праймера (Синтол, РФ) и 10 ед. ревертазы M-MLV (СибЭнзим, РФ). Проводят отжиг random гексамеров и специфического праймера на матрице мРНК при температуре 75°С в течение 3-х мин. Остальные компоненты реакции добавляют при температуре +4°С. Дальнейшую инкубацию проводят при температуре 37°С в течение 1 ч, инактивацию фермента проводят при 94°С в течение 5 мин. Полученную кДНК хранят при -70°С.

В качестве контроля прохождения реакции обратной транскрипции и для стандартизации метода используют ПЦР-систему на определение экспрессии гена -актина.

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени ставят с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, Россия) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляют по 2 мкл кДНК, полученной при реакции обратной транскрипции.

Условия прохождения ПЦР со специфическими праймерами к гену -актину и гену TLR2 были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК, опубликованными в базе данных Gene Bank. Отрицательным контролем служит проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК.

ПЦР в реальном времени проводят на приборе АНК-16 (Синтол, РФ) по следующей схеме (94°С 15 с и 60°С 50 с) 40 циклов.

Полученные результаты анализируют с помощью лицензированной программы, прилагающейся к прибору АНК-16. Расчет количества копий TLR2 проводится относительно 1×10⁶ копий -актина.

У данной пациентки число копий кДНК TLR2 составляло 212750 относительно 1×10⁶ копий кДНК -актина.

Пример № 2.

Беременная Т. 28 лет с диагнозом 1 срочные роды. Гестационные отеки. ОГА. Уреаплазмоз. Носитель ВПГ. Угроза разрыва промежности. Эпизиотомия. Медицинский сон. Эпизиоррафия.

Пациентка состояла на учете с 17-18 недель беременности, условия жизни – средние, профессия – визажист. Во время беременности в первом триместре отмечала тошноту. Соматических заболеваний нет. Менструальная функция с 14 лет, по 5 дней, через 21-45 дней. Данная беременность первая, наступила спонтанно. Рост 166 см, вес 68,5 кг (до беременности 56 кг). Группа крови первая, резус положительный. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики, выявлен вирус простого герпеса, уреплазмоз. Родовая деятельность развивалась самостоятельно, без родовозбуждения. Учитывая роды в ночное время суток и утомленность родильницы, во время родов проводился медицинский сон – отдых. Общая продолжительность родов составила 6 ч 30 мин, без вод – 15 мин (характер околоплодных вод – светлые). Ребенок родился живой, доношенный, пол – мужской, 3320 г, 48 см. Оценка по шкале Апгар на первой минуте составила 8 баллов, на пятой минуте 9 баллов. Мать и ребенок выписаны на 3 сутки после родов.

Количество копий кДНК TLR2 у данной пациентки методом (см. пример №1) составляет 467592 относительно 1×10⁶ копий кДНК -актина.

Пример №3.

Пациентка Г. 26 лет с диагнозом: 1 преждевременные роды в 29 нед. Отягощенный гинекологический анамнез. Уреаплазмоз. Носитель ЦМВ, ВПГ. Преждевременный разрыв плодных оболочек. Хроническая плацентарная недостаточность. Низкая плацентация. Обострение хронической внутриутробной гипоксии плода. Относительная короткость пуповины. Дефект плаценты. Эпизиотомия. Ручное обследование стенок полости матки. Эпизиоррафия. Эпидуральная анестезия.

Пациентка состояла на учете с 18 недель беременности, условия жизни – средние, домохозяйка. Соматически не отягощена. Менструальная функция не нарушена. Данная беременность вторая, первая в 2001 году – медицинский аборт на сроке гестации 8 недель, без осложнений. Рост 165 см, вес 68,2 кг (до беременности 60 кг). Группа крови первая, резус – положительный. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики, был выявлен уреаплазмоз, носитель ЦМВ, ВПГ. Роды осложнились преждевременным разрывом плодных оболочек. Во время родовой деятельности – обострение хронической внутриутробной гипоксии плода. Общая продолжительность родов составила 6 ч 50 мин, без вод – 8 ч. Роды, учитывая срок гестации, обезболивались эпидуральной анестезией. Ребенок родился живой, недоношенный, пол – мужской, 1210 г, 37 см. Оценка по шкале Апгар на первой минуте 6 баллов, на пятой – 7 баллов. Мать выписана на 5 сутки после родов. Ребенок был переведен на второй этап выхаживания после пребывания в реанимационном отделении.

Количество копий кДНК TLR2 у данной пациентки методом (см. пример № 1) составляет 1088200 относительно копий 1×10⁶ кДНК -актина (в 5 раз превышает средний показатель контрольной группы).

Таким образом, предложенный способ достаточно практичен и пригоден для широкого клинического применения, достоверность прогноза достаточно высока и превосходит по информативности все ранее аналогичные методики. Заявленное изобретение позволяет решать важную практическую задачу оптимального прогнозирования преждевременных родов, что весьма важно в практическом отношении, и основано на конкретных показателях. Использование данного способа будет способствовать правильному ведению беременности, прогнозированию преждевременных родов.

Формула изобретения

Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции, включающий исследование цервикального канала, отличающийся тем, что исследуют эпителиальные клетки слизистой оболочки, в которых с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют уровень экспрессии гена Toll-подобного рецептора 2 (TLR2) и при его увеличении более чем в пять раз по сравнению с его уровнем, установленным при нормально протекающей беременности, прогнозируют преждевременные роды.

РИСУНКИ