Патент на изобретение №2333963

(54) ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ЭРЕМОМИЦИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к технологии очистки гликопептидов. Осветленную жидкость, содержащую эремомицин, компактируют с сульфированным стирол-дивинилбензольным катионитом, проводят элюирование и нанесение нейтрализованного элюата на колонку с гидрофобным стирол-дивинилбензольным сорбентом. После промывки колонки водой производят вытеснение эремомицина раствором изопропилового спирта с добавкой уксусной кислоты и производят кристаллизацию целевого продукта. Способ позволяет получить чистый продукт с высоким выходом при высокой производительности процесса. 5 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области хроматографического разделения и очистки и может быть использовано для получения высокоочищенных полициклических гликопептидов, в частности антибактериального антибиотика эремомицина.

Известен способ очистки гликопептидного антибиотика ванкомицина, включающий последовательную очистку осветленного после ферментера раствора на колонке с сорбентом DOWEX 50 WX2, а затем на колонке AMBERLITE XAD-16 и кристаллизацию при рН от 9 до 9,5. Чистота продукта не превышает 92% (US 5574135, 12.11.1996).

Известен способ очистки ванкомицина, включающий его сорбцию на сильнокислотном катионите, элюирование раствором NH₄OH, доведение рН до 3-5, сорбцию на слабоосновном анионите, а затем на оксиде алюминия, элюирование водой, нанесение элюата на гидрофобный адсорбент, элюирование раствором спирта, добавление к элюату соляной кислоты и водорастворимого органического растворителя и кристаллизацию (US 7018814, 28.03.2006). Ванкомицин получают с чистотой 95%.

Известен способ доочистки эремомицина на различных карбоксильных катионитах. Найдены оптимальные условия сорбции эремомицина на этих катионитах (I.V.Polyakova et all “Mass transfer effect in preparative chromatography of eremomycin on polymeric sorbents”. Journal of Cromatography A, 1006, 2003, p.251-260). Однако в упомянутой работе не предложена конкретная схема очистки осветленного после ферментера раствора до получения товарного продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки эремомицина, включающий сорбцию осветленного после ферментера раствора на карбоксильном катионите (КБ-2) при рН 6,5, десорбцию эремомицина 0,5 н. раствором аммиака, обессоливание раствора на сульфокатионите КУ-2-20 и анионите ЭВЭ-10П с последующим нанесением элюата при рН 5±0,5 на сорбент на основе гидрофобизированного макропористого стекла (ПТФЭ), элюирование дистиллированной водой, концентрирование упариванием в вакууме до содержания эремомицина 120-140 г/л с последующей кристаллизацией 20%-ным этиловым спиртом. Выход очищенного продукта составляет 60-65%, чистота по ВЭЖХ 97% (Патент РФ 21105578, 1998).

Недостатки известного способа следующие.

Недостаточное гидрофобное связывание ПТФЭ сорбентом эремомицина приводит к необходимости вводить две дополнительные стадии обеззоливания (обессоливания) с использованием катионита КУ-2-20 и анионита ЭВЭ-10П. Это снижает производительность процесса и приводит к дополнительным потерям продукта.

Невозможность достаточного концентрирования на стадии гидрофобной очистки на ПТФЭ сорбенте приводит к низкой концентрации эремомицина, что требует стадии упаривания перед кристаллизацией и приводит к дополнительным энергетическим и временным затратам.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа очистки с достижением высокого выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная задача решается описываемым хроматографическим способом очистки эремомицина, который включает сорбцию эремомицина из осветленной культуральной жидкости на катионите, элюирование раствором, содержащим ионы аммония, нейтрализацию элюата, нанесение нейтрализованного элюата на колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, промывку колонки водой, вытеснение с колонки эремомицина и его кристаллизацию. В качестве катионита используют сульфированный стирол-дивинилбензол в протонированной форме, в качестве гидрофобного сорбента используют стирол-дивинилбензольный сорбент, вытеснение эремомицина осуществляют водным раствором изопропилового спирта с добавкой уксусной кислоты, кристаллизацию осуществляют из раствора, содержащего изопропиловый спирт.

Дополнительно после кристаллизации продукт промывают этанолом и высушивают под вакуумом.

Предпочтительно элюирование с катионита проводят раствором, содержащим хлорид и сульфат аммония, имеющим рН 9-10.

Нейтрализацию элюата проводят до рН 6,0-7,5.

Вытеснение эремомицина со стирол-дивинилбензольного гидрофобного сорбента проводят 3%-ным раствором изопропилового спирта в воде, содержащим 0,1 моль/л уксусной кислоты.

Кристаллизацию эремомицина осуществляют из 60-70%-ного раствора изопропилового спирта.

Технический результат, заключающийся в упрощении способа, повышении производительности процесса при высоком выходе чистого продукта, достигается в объеме вышеизложенной совокупности признаков.

Использование на первой стадии сорбции сульфокатионита на основе стирол-дивинилбензола позволяет избежать влияния солевого состава воды и увеличить производительность в 3 раза за счет большей скорости пропускания раствора (2,6-3,25 мл/см²/мин).

Применение на стадии гидрофобной хроматографии стирол-дивинилбензольного сорбента обеспечивает более эффективное связывание эремомицина. Элюирование осуществляется водой с добавкой изопропилового спирта и уксусной кислоты, а не дистиллированной водой, что позволяет удалить растворенные соли промывкой колонны с сорбированным эремомицином водой и избежать двух стадий обессоливания на катионите и анионите перед гидрофобной хроматографией. Это значительно повышает общую производительность процесса и снижает потери целевого продукта.

Более эффективное связывание эремомицина стирол-дивинилбензольным сорбентом обеспечивает возможность его элюирования с колонки в концентрированном виде и не требует дополнительного упаривания, что повышает производительность и снижает энергозатраты процесса.

Очистку эремомицина осуществляют следующим образом.

Пример 1. Осветленный после ферментера раствор в объеме 1100 л, содержащий 500 г эремомицина, доведенный до значения рН 7,5, наносят на колонку размером 140×1000 мм, содержащую 7 л сульфокатионита (сульфированный стирол-дивинилбензол, Е=3,5 мЕ/г) со скоростью 500 мл/мин. Колонку промывают деионизованной водой (4 объема колонки). Элюирование эремомицина проводят 18 литрами 0,3 М раствора хлористого аммония, содержащего 0,03 М сульфата аммония, доведенного до рН 9,5 аммиаком. Содержание эремомицина в элюате составляет 25 мг/мл.

Нейтрализованный раствором серной кислоты до рН 6,6 раствор эремомицина наносят на колонну 140×1000 мм, содержащую 10 литров гидрофобного полимерного стирол-дивинилбензольного сорбента (сополимер дивинилбензола и этилстирола, диаметр пор 9 нм, объем пор 1,9 мл/г, размер частиц 150-300 мкм) со скоростью 125 мл/мин. Колонну промывают 2,5 литрами дистиллированной воды, затем элюируют 3%-ным раствором изопропилового спирта, содержащего 0,1 М уксусной кислоты. Получают 8 литров раствора с содержанием эремомицина 50 мг/мл. Осаждение и кристаллизацию эремомицина осуществляют, добавляя в раствор изопропиловый спирт до содержания 60% при рН 6,6 и температуре 4°С в течение 30 часов. Осадок отфильтровывают и промывают 2 литрами этанола. Продукт высушивают под вакуумом при температуре 30°С. Получают 412 г очищенного продукта. Выход 82%, чистота по ВЭЖХ более 98%.

Пример 2. 100 л осветленной культуральной жидкости, содержащей 60 г эремомицина, доведенной до рН 7,0, пропускают через колонку 50×500 мм с сульфокатионитом в Н⁺ форме со скоростью 60 мл/мин. Колонку промывают 3 литрами дистиллированной воды. Элюирование проводят буферным раствором с рН 10,0, содержащим 0.3М хлористого аммония, 0,03М сульфата аммония. Элюат объемом 900 мл нейтрализуют соляной кислотой до рН 6,0 и пропускают через колонку 50×500 мм, заполненную стиролдивинилбензольным сорбентом со скоростью 30 мл/мин. Колонку промывают 250 мл дистиллированной воды и элюируют эремомицин 600 мл раствора, содержащего 3% изопропилового спирта и 0,1М уксусной кислоты. К 600 мл элюата добавляют 1400 мл изопропилового спирта (до 70%-ного его содержания), перемешивают 2,5 часа и помещают в холодильник на 24 часа. Осадок эремомицина переносят на стеклянный фильтр Шота №4 и промывают спиртом этиловым под вакуумом. Образовавшийся подсушенный осадок помещают на стеклянный лоток, сушат в течение суток на воздухе (под вытяжным шкафом). Окончательную сушку проводят в вакуум-сушильном шкафу при 30°C. Получают 45 г эремомицина. Выход 75%, чистота по ВЭЖХ более 98%.

Пример 3. 100 л осветленной культуральной жидкости, содержащей 65 г эремомицина, доведенной до рН 6,3, пропускают через колонку 50×500 мм с сульфокатионитом в Н⁺ форме со скоростью 60 мл/мин. Элюирование осуществляют 0.3М раствором хлористого аммония, содержащего 0,03М сульфата аммония с рН 9,0. Элюат объемом 850 мл нейтрализуют соляной кислотой до рН 7,5. Сорбцию и элюирование на стирол-дивинилбензольном сорбенте осуществляют по примеру 2. К элюату объемом 700 мл добавляют 1630 мл изопропилового спирта при перемешивании и через 3 часа емкость помещают в холодильник. Через 24 часа осадок эремомицина переносят на стеклянный фильтр Шотта и сушат, как описано в примере 2. Получают 49 г эремомицина. Выход 75%, чистота по ВЭЖХ более 98%.

Как видно из приведенных примеров, поставленная задача решена. Целевой продукт получен по упрощенной технологии с обеспечением высокого выхода и чистоты.

Формула изобретения

1. Хроматографический способ очистки эремомицина, включающий сорбцию эремомицина из осветленной культуральной жидкости на катионите, элюирование раствором, содержащим ионы аммония, нейтрализацию элюата, нанесение нейтрализованного элюата на колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, промывку колонки водой, вытеснение с колонки эремомицина и его кристаллизацию, отличающийся тем, что в качестве катионита используют сульфированный стирол-дивинилбензольный сорбент, в качестве гидрофобного сорбента используют стирол-дивинилбензольный сорбент, вытеснение эремомицина осуществляют водным раствором изопропилового спирта с добавкой уксусной кислоты и кристаллизацию осуществляют из раствора, содержащего изопропиловый спирт.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после кристаллизации продукт дополнительно промывают этанолом и высушивают под вакуумом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование с катионита проводят раствором, содержащим 0,3М хлорида аммония и 0,03М сульфата аммония, имеющим рН 9-10.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что нейтрализацию элюата проводят до рН 6,0-7,5.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что вытеснение эремомицина со стирол-дивинилбензольного сорбента проводят 3%-ным раствором изопропилового спирта в воде, содержащем 0,1 моль/л уксусной кислоты.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что кристаллизацию эремомицина осуществляют из 60-70%-ного раствора изопропилового спирта.