Патент на изобретение №2333962

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА ИЗ СУХОЙ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению полигидроксибутирата (ПГБ) из сухой биомассы микроорганизма, полученной ферментативным синтезом. Способ состоит в том, что сухую биомассу микроорганизма рода Azotobacter с содержанием ПГБ от 50 до 75%, азота от 1,2 до 3,5% и золы от 10 до 25% экстрагируют хлороформом при температуре 30-40°С и концентрации ПГБ в хлороформе от 0,3 до 0,55 г/л, подавая раствор ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт равномерно со скоростью от 1 до 3 л/час с последующим отделением и сушкой целевого продукта. Изобретение позволяет выделить ПГБ медицинского назначения с заранее заданной молекулярной массой, выходом 95-98,5% и чистотой 99,5-99,95% при продолжительности процесса 8-10,5 часов. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности выделению полигидроксибутирата (далее – ПГБ) из биомассы, полученной ферментативным синтезом.

Под биомассой подразумевают совокупность всех органических веществ, которые продуцируются при определенных условиях клетками животных, растений или микроорганизмов, включая генетически модифицированные формы. ПГБ представляет собой пластичный, биодеградабельный и биосовместимый полимер, который может найти применение прежде всего в медицине, а также в сельском хозяйстве и промышленности.

Отделение ПГБ от клеточного материала представляет весьма сложную задачу.

Использование традиционных способов выделения, широко применяемых в экстракции растительных масел из масличных семян, например механическое прессование, седиментация, не дают желаемого результата.

Методы выделения различных веществ, применяемые в химической технологии и описанные в литературе, сводятся в основном к экстракции целевого продукта, в данном случае ПГБ, из сухой или из сырой биомассы.

Если экстракция проводится из сухой биомассы, то ей предшествует обработка сырой биомассы, содержащей целевой продукт – ПГБ, органическим растворителем, нерастворяющим ПГБ (далее – нерастворитель), с целью освобождения от воды, липидов, неорганических солей и других примесей; отделение осадка – клеточной массы, содержащей ПГБ, известными способами – фильтрацией или центрифугированием и ее сушка (ЕР №0015123, С12Р 7/62, опубл. 22.12.1982 г.; пат. США №3036959, НКИ 435-146, МПК С12Р 7/62, опубл. 29.05.1962 г.; пат. США №3044942, НКИ 195-47, класс по МПК – не указан, опубл. 17.07.1962 г.). В частности, в ЕР №0015123 предлагается для осушки сначала через сырую биомассу пропустить поток газа при температуре не менее 100°С для испарения воды, а затем обработать ее ацетоном или метанолом. Ацетон используется также и в способах выделения ПГБ, защищенных патентами США №3036959 и №3044942.

Непосредственно сама экстракция ПГБ из сухой биомассы осуществляется растворителем ПГБ, отделяется клеточная масса известными способами – фильтрацией или центрифугированием, затем проводится осаждение целевого продукта – ПГБ нерастворителем, его отделение и сушка.

В случае прямой экстракции ПГБ из сырой биомассы последняя обрабатывается растворителем ПГБ, отделяется органическая фаза, содержащая ПГБ, фильтрацией или центрифугированием; затем проводится осаждение ПГБ нерастворителем, отделение осадка ПГБ центрифугированием, фильтрацией или в обогреваемом сепараторе и сушка целевого продукта.

Необходимо отметить, что в последнее время в большинстве случаев при прямой экстракции проводится подсушивание сырой биомассы, например, центрифугированием в дисковом сепараторе (заявка ФРГ №4036067, С12Р 7/62, опубл. 14.05.1992 г.), пропусканием газа с температурой 100-500°С (пат. США №4324907, НКИ 560-185, МПК С07С 67/56, опубл. 13.04.1982 г.).

В качестве экстрагирующего растворителя используются частично галогенированные углеводороды, такие как 1,2-дихлорэтан, хлороформ (ЕР №0015123, ЕР №0015669, С12Р 7/62, опубл. 17.09.1980 г.; пат. США №4324907); 1,1,2-трихлорэтан, 1,1,2,2-тетрахлорэтан (пат. США №4310684, НКИ 560-185, МПК С07С 69/675, опубл. 12.01.1982 г.), метиленхлорид (заявка ФРГ №4036067). Как правило, процесс осуществляется при температуре более 40°С. Причем среди них есть такие как, например, хлороформ, с которыми получается сравнительно хороший выход, и такие как, например, 1,2-дихлорэтан, с которыми получается чистый ПГБ.

В патенте ФРГ №19533459 (С08G 63/89, опубл. 28.11.1996 г.) и заявке ФРГ №19623778 (С08G 63/90, опубл. 14.06.1996 г.) используются метил- и этиллактаты, но при этом температуры экстракции высоки (например, для этиллактата – 154°С). В заявке ФРГ №19712702 (С08G 63/06, опубл. 01.10.1998 г.) описано применение уксусной кислоты, а в заявке ГДР №229428 (С12Р 7/62, опубл. 06.11.1985 г.) – уксусный ангидрид. Но в этих растворителях уже вблизи 70°С происходит гелеобразование и смешение с побочными компонентами биомассы. При этом часть растворителя сохраняется в ПГБ, придавая продукту специфический запах. Не исключается также возможный гидролиз ПГБ с уменьшением молекулярной массы. В патенте ФРГ №19955381 (С12Р 7/62, опубл. 22.02.2001 г.) описывается экстракция 1-метил-2-пирролидоном при 80-120°С, причем при экстракции прибавляется связывающее воду вещество, предпочтительно уксусный ангидрид. По патенту США №3036959 экстракция осуществляется с использованием пиридина при температуре более 40°С.

Для осаждения ПГБ из органической фазы используют воду, метанол или их смесь, ацетон, петролейный эфир, неполярные растворители.

Сушка целевого ПГБ, предложенная в различных патентах, осуществляется при температуре от 50 до 80°С.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ выделения ПГБ из биомассы, описанный в заявке ФРГ №4036067 (С12Р 7/62, опубл. 14.05.1992 г.). В соответствии с этим источником сухая биомасса обрабатывается с целью экстракции ПГБ хлоруглеводородом – метиленхлоридом (несмешивающимся с водой растворителем и имеющим температуру кипения ниже 100°С) – при нагревании в течение 30 минут. Затем отделяется клеточный материал центрифугированием со скоростью 2200 об/мин в течение 30 минут. Далее оставшаяся органическая фаза, содержащая ПГБ, впрыскивается в воду, нагретую выше температуры кипения растворителя (˜80°С). Впрыскивание проводится со скоростью 300 л/час действием водяного пара с давлением 3 бар с помощью двойного сопла с диаметром 4 мм для раствора ПГБ и кольцевого зазора около 2 мм для пара. ПГБ выпадает в виде хлопьев, часть воды испаряется. Суспензия перемешивается в течение 30 минут при температуре 80°С. Затем целевой продукт отделяется центрифугированием и сушится при 80°С в течение 24 часов.

Выход продукта – 85%, чистота – 99%.

Следует отметить, что предварительно при приготовлении сухой биомассы часть воды из сырой биомассы удаляется центрифугированием в дисковом сепараторе.

К недостаткам данного способа можно отнести следующие: хотя вода является дешевым и нетоксичным реагентом, однако использование больших ее количеств, в частности, на стадии удаления метиленхлорида приводит, с одной стороны, к необходимости ведения процесса при повышенной температуре (80°С) и, с другой – к протеканию процесса гидролиза полимера, что влечет за собой существенное снижение его молекулярной массы и препятствует получению полимера с заранее заданной молекулярной массой. Снижению молекулярной массы полимера способствует также и необходимость длительной сушки (до 24 час) выделенного из раствора ПГБ от воды при повышенной температуре (80°С). Небольшой выход готового продукта 85% является также результатом применения для его очистки больших количеств воды, а наличие даже малой примеси метиленхлорида делает невозможным применение такого ПГБ в медицинских целях.

Техническая задача предлагаемого изобретения состоит в получении ПГБ медицинского назначения с заранее заданной молекулярной массой и повышенной чистотой полимера, а также ускорении технологического процесса выделения целевого продукта.

Технический результат, состоящий в получении ПГБ с молекулярной массой 300-1200 кДа, выходом не менее 90% и чистотой не менее 99,2% при сокращении времени процесса, достигается тем, что в способе выделения ПГБ из сухой биомассы микроорганизма, включающем экстракцию ПГБ хлоруглеводородом и отделение клеточного материала с последующим осаждением ПГБ из хлоруглеводорода при перемешивании, отделением и сушкой целевого продукта, в качестве сухой биомассы микроорганизма используют биомассу микроорганизма рода Azotobacter с содержанием ПГБ от 50 до 75%, азота от 1,2 до 3,5% и золы от 10 до 25%, в качестве хлоруглеводорода применяют хлороформ, экстракцию осуществляют при температуре 30-40°С и концентрации ПГБ в хлороформе от 0,3 до 0,55 г/л, а осаждение проводят путем равномерной подачи раствора ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт, причем скорость подачи составляет от 1 до 3 л/час.

Сырую биомассу с содержанием сухого остатка 24-32%, полученную ферментативным способом с использованием микроорганизма рода Azotobacter, подготавливают любыми известными способами: путем промывки ее изопропиловым спиртом, вакуумной фильтрации изопропилового спирта с растворенными в нем липидными соединениями, подсушки и дробления отмытой биомассы до порошкообразного состояния.

Предложенное техническое решение иллюстрируется следующими примерами (1-19). Следует отметить, что в примерах 1-13 и 17-19 используется сухая биомасса, полученная ферментативным способом с использованием штамма микроорганизма Azotobacter chroococcum 7Б; в примере 14 – с использованием штамма микроорганизма Azotobacter chroococcum 12A; в примере 15 – с использованием штамма микроорганизма Azotobacter chroococcum 35 и в примере 16 – с использованием штамма микроорганизма Azotobacter vinelandii 21.

Пример 1.

В трехгорлую колбу емкостью 3 литра, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником и термометром, загружают 16 г сухой биомассы с содержанием ПГБ 70%, азота 1,66%, золы 13% и 1500 мл хлороформа. Включают мешалку и содержимое колбы интенсивно перемешивают в течение 2 часов при температуре 38°С, поместив колбу в нагреваемую водяную баню. В колбе получают суспензию сухой биомассы в хлороформе.

Полученную суспензию отфильтровывают на воронке Бюхнера через два слоя фильтрующего материала (бельтинг и капрон) при вакууме 15 мм рт.ст. ост. и комнатной температуре. На фильтре образуется осадок, который представляет собой побочный продукт очистки сухой биомассы – клеточный материал.

Содержание ПГБ, находящегося в растворе хлороформа, равно 11,2 г, что соответствует 0,5% концентрации его в растворе.

Далее в трехгорлую колбу емкостью 8 л, снабженную механической мешалкой, термометром, обратным холодильником, капельной воронкой, загружают 4500 мл изопропилового спирта. Включают мешалку и при интенсивном перемешивании содержимого колбы подают из капельной воронки 1500 мл 0,5% раствора ПГБ в хлороформе со скоростью 1,3 л/час. При этом ПГБ выделяется из раствора в виде белых хлопьев. По окончании введения раствора ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт мешалку выключают и оставляют образовавшийся гель для созревания на 1 час при комнатной температуре. Затем гель отфильтровывают на воронке Бюхнера через два слоя фильтровального материала (бельтинг и капрон) при вакууме 15 мм рт.ст. ост. Гель счищают с фильтрующего материала и снова помещают в трехгорлую колбу емкостью 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром и обратным холодильником, куда загружают 350 мл изопропилового спирта, включают мешалку и проводят дополнительную промывку изопропиловым спиртом в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем мешалку выключают, а осадок отфильтровывают от изопропилового спирта на воронке Бюхнера через два слоя фильтрующего материала (бельтинг и капрон) при вакууме 15 мм рт.ст. ост. и комнатной температуре. Осадок высушивают в сушильном шкафу при температуре 58-60°С в течение 2 часов. Получают 11,03 г (98,5%) ПГБ с содержанием основного вещества 99,95%, азота 0,1%, молекулярной массой 300 кДа.

Сырую биомассу с содержанием сухого остатка 24-32% предварительно подготавливают путем промывки ее изопропиловым спиртом, вакуумной фильтрации изопропилового спирта с растворенными в нем липидными соединениями, подсушки и дробления отмытой биомассы до порошкообразного состояния.

Сведения по примерам 2-16 (в соответствии с изобретением), 17-18 (сравнительные – при параметрах, выходящих за заявленные пределы) осуществляются по методике, описанной в примере 1, пример 19 – воспроизведение прототипа, приведены в таблице.

Сопоставление предложенного способа со способом по прототипу затруднено тем, что способ по прототипу осуществлен не в лабораторных условиях, а на камеральной установке. В связи с этим способ по прототипу воспроизведен нами в лабораторных условиях.

Пример 19 (по прототипу).

В трехгорлую колбу емкостью 2 л, снабженную водяной баней, механической мешалкой, обратным холодильником и термометром, загружают 39 г сухой биомассы. К ней прибавляют 156 мл метиленхлорида и нагревают с обратной конденсацией 30 минут. Полученную смесь центрифугируют для отделения органического раствора ПГБ от водной фазы клеточного материала микроорганизмов.

Органическую фазу впрыскивают при 80°С в пятигорлую колбу емкостью 2 л, снабженную термометром, механической мешалкой, обратным холодильником, двойным соплом, и содержащую 320 мл воды. Впрыскивание органической фазы со скоростью 50 л/час производят действием водяного пара давлением 0,5 бар с помощью двойного сопла с диаметром 1 мм для раствора и кольцевого зазора около 0,5 мм – для пара. Постоянство температуры поддерживают с помощью водяной бани. При этом выпадают хлопья ПГБ и испаряется часть воды. По окончании впрыскивания перемешивают суспензию 30 минут при 80°С. Наконец, снова центрифугируют массу в той же центрифуге и высушивают хлопья ПГБ в полочной сушилке при 80°С в течение 12 часов. При этом получают 9,5 г ПГБ (выход 85%) с чистотой 99,0% и содержанием метиленхлорида менее 1 млн.д. Продолжительность процесса составляет 14 часов.

Для приготовления сухой биомассы предварительно часть воды удаляют из сырой биомассы центрифугированием в дисковом сепараторе.

Представленные примеры подтверждают достижение следующего технического результата:

– полученный ПГБ обладает свойствами, позволяющими использовать его в медицине в виде пленок и нитей, например, как шовный биоразлагаемый материал, который не требует удаления с течением времени;

– получен ПГБ с заранее заданной молекулярной массой 300-1200 кДа;

– выход ПГБ составляет 95,0-98,5% против 85% по прототипу;

– чистота ПГБ 99,5-99,95% против 99,0% по прототипу;

– продолжительность процесса сократилась с 14 часов до 8-10,5 часов по сравнению с прототипом.

Кроме того, предлагаемая технология выделения ПГБ малоотходна, т.к. большая часть растворителей возвращается в процесс и находится в цикле.

При этом полученный технический результат не является очевидным. Казалось бы, логичнее при осаждении ПГБ из раствора, поскольку в реакторе находится раствор ПГБ в хлороформе, подавать туда осадитель – изопропиловый спирт. Однако обнаружилось, что при таком порядке ведения процесса увеличивается время осаждения полимера из раствора, снижается чистота продукта; при обратном же порядке введения реагентов, т.е. при равномерном добавлении раствора ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт с определенной скоростью, удается получить продукт улучшенного качества при ускорении процесса.

Формула изобретения

Способ выделения полигидроксибутирата из сухой биомассы микроорганизма, включающий экстракцию полигидроксибутирата хлоруглеводородом и отделение клеточного материала с последующим осаждением полигидроксибутирата из хлоруглеводорода при перемешивании, отделением и сушкой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сухой биомассы микроорганизма используют биомассу микроорганизма рода Azotobacter с содержанием полигидроксибутирата от 50 до 75%, азота от 1,2 до 3,5% и золы от 10 до 25%, в качестве хлоруглеводорода применяют хлороформ, экстракцию осуществляют при температуре 30-40°С и концентрации полигидроксибутирата в хлороформе от 0,3 до 0,55 г/л, а осаждение проводят путем равномерной подачи раствора полигидроксибутирата в хлороформе в изопропиловый спирт, причем скорость подачи составляет от 1 до 3 л/ч.