Патент на изобретение №2333952

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН b2383

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет собой способ получения L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген b2383. Изобретение позволяет получить L-треонин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислот с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена b2383 (ypdD).

Предшествующий уровень техники

Белок B2383 (YpdD) предположительно является компонентом фермента IIa, ферментом I системы ФТС (фосфотрансферазной системы сахаров). ФТС состоит из двух цитоплазматических и энергетически сопряженных белков (срединный компонент фермента I и N-терминальный компонент Hpr) и цепи карбогидратспецифических Ферментов II (С-терминальный компонент фермента IIa), которые катализируют сопутствующие процессы транслокации и фосфорилирования карбогидратов. Процессы потребления и фосфорилирования сопряжены, делая систему ФТС связующим звеном между процессами поглощения и метаболизма сахаров. Фосфоенолпируват является первичным донором фосфата. Фосфоенолпируват передает фосфатную группу по пути сигнальной трансдукции ферменту 1 (E1), который, в свою очередь, переносит на гистидин белка, HP. Следующий этап в системе включает сахар-специфический мембраносвязанный комплекс, фермент 2 (EII), который переносит сахар в клетку. Комплекс включает пермеазу сахара, которая катализирует транспортные реакции. EII обычно подразделяется на три различных домена, EIIA, EIIB, и EIIC (Aboulwafa M. et al., Molecular Microbiology, 48(1), 131-141 (2003)).

Более чем 20 карбогидратов могут быть транспортированы в бактериальную клетку с помощью системы фосфоенолпируват : карбогидратфосфотрансферазы (ФТС), которая широко распространена среди бактерий. Эти свойства ФТС обеспечивают бактериальную клетку интегрированной системой, которая гарантирует оптимальное усвоение карбогидратов в комплексном микроокружении.

Однако в настоящее время отсутствуют сообщения об инактивации гена b2383 (гена ypdD) для целей получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием указанных штаммов.

Данные цели были достигнуты путем обнаружения того факта, что инактивация гена b2383 может повысить продукцию L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии – продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия была модифицирована таким образом, что экспрессия гена b2383 в этой бактерии ослаблена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом экспрессия гена b2383 ослаблена путем инактивации гена b2383.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:

– выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и выделения L-аминокислоты в культуральную жидкость, и

– выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерия согласно настоящему изобретению – это бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты, при этом бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена b2383 у этой бактерии ослаблена.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.

Термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты» в качестве применяемого здесь термина также означает бактерию, способную продуцировать и вызывать накопление любой L-аминокислоты в питательной среде в больших количествах по сравнению с диким типом или родительским штаммом Е. coli, таким как штамм Е. coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Предпочтительными, в частности, являются L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, но не ограничивается только ею, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были заново классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Термин «бактерия, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии экспрессия гена b2383 ослаблена», означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит меньшее количество белка В2383 по сравнению с немодифицированной бактерией или что модифицированная бактерия становится неспособной синтезировать белок В2383.

Термин “инактивация гена b2383” означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Возможно также, что модифицированный участок ДНК неспособен нормально экспрессировать ген в результате делеции части гена, сдвига рамки считывания гена, введения missense/nonsense мутации(й) или модификации прилегающей к гену области в результате включения последовательностей, контролирующих экспрессию гена, таких как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, сайты связывания рибосомы и т.д.

Уровень экспрессии гена можно оценить путем измерения количества мРНК, транскрибируемой с гена, с использованием ряда известных методов, включая блотинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и подобные им. Количество белка, кодируемого геном, можно измерить известными методами, включая SDS-PAGE с последующим иммуноблотингом (Вестерн блотингом) и подобными им.

Ген b2383 (синонимы – ypdD, fryA) кодирует белок В2383 (синонимы: предположительный N-терминальный компонент Hpr семейства PTS, средний компонент фермента I, С-терминальный компонент фермента IIa, FryA, YpdD). Ген b2383 (нуклеотиды комплементарны нуклеотидам с номерами с 2500012 по 2502507 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2; gi: 49175990; в базе данных GenBank; SEQ ID NO: 1) располагается между генами ypdC и ypdE на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена b2383 и аминокислотная последовательность кодируемого им белка В2383 приведена в Списке последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно.

Поскольку в последовательностях ДНК разных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae могут существовать некоторые различия, нуклеотидная последовательность гена b2383, подлежащего инактивации, не ограничивается последовательностью гена, приведенной в SEQ ID No: 1, но также может включать последовательности генов, гомологичных последовательности, приведенной в SEQ ID No: 1. Поэтому вариант белка, кодируемого геном b2383, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительней не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, кодируемой геном b2383 и приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO.2), до тех пор, пока активность белка В2383 сохраняется на том же уровне, как до инактивации.

Кроме того, ген b2383 может быть представлен вариантом, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, при условии, что указанный вариант кодирует функциональный белок таким, каким он был до инактивации. “Жесткие условия” включают такие условия, при которых образуются специфические гибриды, например гибриды, имеющие гомологию 60%, предпочтительней не менее чем 70%, более предпочтительней не менее чем 80% и наиболее предпочтительней не менее чем 90%, а неспецифические гибриды, например гибриды, имеющие меньшую перечисленной выше гомологию, не образуются. Например, демонстрацией жестких условий может служить однократная или многократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная отмывка при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при температуре 60°С. Длина зонда может быть выбрана соответствующим образом в зависимости от условий гибридизации и обычно варьирует в диапазоне от 100 п.о. до 1 тыс.п.о.

Инактивация указанного гена может быть выполнена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработки нитрозогуанидином (N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83) и (Datsenko K.A. and Warmer B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), называемого также “Red-зависимая интеграция”.

Активность белка В2383 может быть измерена методами, описанными, к примеру, ранее (Aboulwafa M. et al., Molecular Microbiology, 48(1), 131-141 (2003)).

Методами приготовления плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерии – продуценты L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, которая модифицирована таким образом, что в ней ослаблена экспрессия гена b2383, может быть использована бактерия, способная продуцировать как ароматические, так и неароматические L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена b2383 в бактерии, уже обладающей способностью продукцировать L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению, может быть получена путем придания бактерии, в которой ген b2383 уже инактивирован, способности продуцировать L-аминокислоты.

Бактерии – продуценты L-треонина

Примеры родительских штаммов для выведения бактерии – продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патент США 5175107, патент США 5705371), Е. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (патент США 5631157), Е. coli NRRL-21593 (патент США 5939307), Е. coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), Е. coli FERM BP-3519 and FERM ВР-3520 (патент США 5376538), Е. coli MG442 (Гусятинер и др. Генетика (в России), 14, 947-956 (1978)), Е. coli VL643 and VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, а также способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа “leaky”. Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая придает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, с существенно десенсибилизированной регуляцией треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Штамм Е. coli ВКПМ В-5318 (Европейский патент ЕР 0593792В) согласно настоящему изобретению также может быть использован в качестве родительского штамма для выведения бактерии – продуцента L-треонина. Штамм В-5318 является прототрофным в отношении изолейцина, а регуляторная область треонинового оперона в плазмиде pVIC40 заменена на репрессор лямбда-фага С1, чувствительный к температуре, и PR промотор. Штамм ВКПМ В-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером VKPM В-5318.

Желательно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких генов, перечисленных ниже:

– мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

– гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

– гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

– гена asd, кодирующего аспартат--полуальдегиддегидрогеназу;

– гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок; и

– гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу);

Ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I Escherichia coli был расшифрован (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентраным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrA расположен между генами thrL и thrB на хромосоме штамма Е. coli К-12. Ген thrB, который кодирует гомосеринкиназу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrB расположен между генами thrA и thrC на хромосоме штамма Е. coli К-12. Ген thrC, который кодирует треонинсинтазу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrC расположен между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ на хромосоме штамма Е. coli К-12. Все три гена функционируют как отдельный оперон треонина. Для усиления экспрессии треонинового оперона из него желательно удалить область аттенуатора, который влияет на транскрипцию (заявки РСТ WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Мутантный ген thrA, который кодирует аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, а также гены thrB и thrC, могут быть получены в составе одного оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая присутствует в штамме-продуценте треонина Е. coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен на 18-й минуте хромосомы Е. coli рядом с glnHPQ опероном, который кодирует компоненты системы глутаминового транспорта. Ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541, gi: 440181 в базе данных GenBank) и расположен между генами рехВ и ompX. Элемент, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был обозначен как ген rhtA (rht: устойчивость к гомосерину и треонину). Также было показано, что мутация rhtA23 является заменой нуклеотидного остатка G на нуклеотидный остаток А в позиции 1 относительно стартового кодона ATG (ABSTRACTS of the 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No.457, EP 1013765 A).

Ген asd E. coli уже описан (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 161313 07 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5:185) с использованием праймеров, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены asd от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Ген aspC Е. coli тоже уже описан (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 16128895 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР. Гены aspC от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Бактерии – продуценты L-лизина

Примеры бактерий – продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично отменяется, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются только ими, оксализин, лизингидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC), -метиллизин, -хлорокапролактам и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обычными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах снижена чувствительность аспартокиназы к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC 196 может быть использован в качестве бактерии – продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был выведен путем придания штамму W3110, производному от штамма Escherichia coli К-12, устойчивости к АЕС. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ 13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря, 1994 г. и получил инвентарный номер PERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер PERM BP-5252 (смотри патент США 5827698).

Примеры родительских штаммов для выведения бактерий – продуцентов L-лизина согласно настоящему изобретению включают штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина, усилена. Примеры ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина, включают, но не ограничиваются только ими, дигидродипиколинатсинтазу (DapA), аспартокиназу (LysC), дигидродипиколинатредуктазу (DapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (LysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США 6040160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатполуальдегиддегидрогеназу (asd) и аспартазу (AspA) (Европейский патент ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, участвующего в эффективном использовании энергии (суо) (Европейский патент ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (PntAB) (патент США 5830716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов для выведения бактерий – продуцентов L-лизина согласно настоящему изобретению включают штаммы, имеющие сниженную или элиминированную активность фермента, который катализирует реакцию образования компонента, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализирует реакцию образования компонента, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5827698) и пируват-малаткарбоксилазу/малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).

Бактерии – продуценты L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-цистеина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е. coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белки, участвующие в процессе секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е. coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патентная заявка Японии JP 11155571 А2); штамм Е. coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307 А1) и им подобные.

Бактерии – продуценты L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий – продуцентов L-лейцина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli, устойчивые к лейцину (например штамм 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121)) или к аналогам лейцина, включающим, например, -2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (патент Японии 62-34397В и патентная заявка Японии 8-70879А); штаммы Е. coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ WO 96/06926; штамм Е. coli H-9068 (патентная заявка Японии JP8-70879A), и им подобные.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, участвующих в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерии – продуценты L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-гистидина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); Е. coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); Е. coli NRRL В-12116 – В12121 (патент США 4388405); Е. coli H-9342 (PERM ВР-6675) и Е. coli H-9343 (PERM ВР-6676) (патент США 6344347); Е. coli H-9341 (PERM ВР-6674) (Европейский патент ЕР 1085087); Е. coli AI80/pFM201 (патент США 6258554), и им подобные.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-гистидина, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина, усилена. Примеры ферментов биосинтеза L-гистидина включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (HisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (HisI), фосфорибозил-АТФ-пирофосфогидролазу (HisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (HisA), амидотрансферазу (HisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (HisC), гистидинолфосфатазу (HisB), гистидинолдегидрогеназу (HisD), и так далее.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI) угнетаются L-гистидином, и поэтому способность продуцировать L-гистидин может быть также эффективно усилена путем введения мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в фермент фосфорибозилтрансферазу (HisG) (патенты РФ 2003677 и 2119536).

Отдельные примеры штаммов, обладающих способностью продуцировать L-гистидин, включают штаммы Е. coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, несущий ДНК, кодирующую ферменты биосинтеза L-гистидина (патентная заявка Японии JP 56-005099 А), штамм Е. coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ-7270, патент РФ 2119536), и так далее.

Бактерии – продуценты L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как Е. coli VL334thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е. coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину и имеет мутации в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). Аллель гена thrC дикого штамма переносили методом основной трансдукции с использованием бактериофага Р1, растущего на клетках штамма дикого типа Е. coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотрофный по L-изолейцину VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961). Этот штамм способен продуцировать L-глутаминовую кислоту.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты, усилена. Примеры ферментов, участвующих в биосинтезе L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобисфосфатальдолазу, фосфофруктокиназу и глюкозофосфатизомеразу.

Примеры штаммов, модифицированных так, что экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, усилена/ы, включают штаммы, описанные в Европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А, и ЕР 952221 А.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы со сниженной или элиминированной активностью фермента, который катализирует синтез компонента, другой чем L-глутаминовая кислота, но ответвляющийся от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, -кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, ацетогидроксикислуюсинтазу, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, дефицитные по активности фермента -кетоглутаратдегидрогеназы или имеющие сниженную активность фермента -кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно они включают нижеследующие штаммы:

E. coli W3110sucA::Kmr

Е. coli AJ12624 (FERM ВР-3853)

Е. coli АJ12628 (FERM BP-3854)

Е. coli АJ12949 (FERM BP-4881)

Е. coli W3110sucA::Kmr является штаммом, полученным путем разрушения гена -кетоглутаратдегидрогеназы (в дальнейшем именуемого как ген “sucA)» в штамме Е. coli W3110. Этот штамм полностью дефицитен по -кетоглутаратдегидрогеназе.

Другие примеры бактерий – продуцентов L-глутаминовой кислоты включают штаммы, которые принадлежат к роду Escherichia и обладают устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты. Эти штаммы могут быть также лишены активности фермента -кетоглутаратдегидрогеназы и включают, к примеру, штаммы Е. coli АJ13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5908768), FFRM Р-12379, который к тому же имеет низкую способность расщеплять L-глутаминовую кислоту (патент США 5393671); АJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и им подобные.

Примеры бактерий – продуцентов L-глутаминовой кислоты включают мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности фермента -кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность фермента -кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены, как описано выше. Такие штаммы включают штамм Pantoea ananatis AJ13356. (патент США 6331419). Штамм Pantoea ananatis AJ13356 был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 19 февраля, 1998 года и получил инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 11 января 1999 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 лишен активности фермента -кетоглутаратдегидрогеназы в результате разрушения субъединицы KGDH-E1 гена sucA. При получении вышеописанный штамм был идентифицирован как штамм Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Однако в последнее время на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S pRNA он был переклассифицирован как принадлежащий к виду Pantoea ananatis. Хотя штамм AJ13356 был депонирован в вышеупомянутый депозитарий как штамм Enterobacter agglomerans, в целях данной цпецификации они описываются как штаммы Pantoea ananatis.

Бактерии – продуценты L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-фенилаланина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются только ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Е. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКПМ В-8197); Е. coli HW1089 (АТСС 55371) несущий ген рНеА34 (патент США 5354672); Е. coli MWEC101-b (KR8903681); Е. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952). Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы штаммы Е, coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), Е. coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), Е. coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и Е. coli К-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ] названный AJ 12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, могут использоваться бактерии – продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с усиленной активностью белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1 соответственно).

Бактерии – продуценты L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli JP 4735/pMU3028 (DSM10122) и JP 6015/pMU91 (DSM10123), лишенными фермента триптофанил-тРНК-синтетаза, кодируемого мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е. coli SV164 (pGH5) с аллелем serA, кодирующим фосфоглицератдегидрогеназу со снятым ингибированием серином по типу обратной связи и аллелем trpE, кодирующим антранилатсинтазу со снятым ингибированием триптофаном по принципу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные фермента триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, в котором усилена способность продуцировать фосфоенолпируват (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696) и подобные им могут быть использованы.

Ранее было установлено, что ген yddG, кодирующий белок мембраны, который не участвует в пути биосинтеза никакой L-аминокислоты, придает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аминокислотным аналогам, при условии если аллель дикого штамма этого гена амплифицировать на мультикопийном векторе в микроорганизме. Помимо этого ген yddG может усилить продукцию L-фенилаланина или L-триптофана при условии, если ввести дополнительные копии в клетки соответствующих штаммов-продуцентов (заявка РСТ WO 03044192). Поэтому желательно, чтобы бактерия – продуцент L-триптофана была в дальнейшем модифицирована таким образом, чтобы иметь усиленную экспрессию открытой рамки считывания yddG.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых усилены одна или более активностей ферментов, выбранных из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы и триптофансинтазы. Ферменты антранилатсинтаза и фосфоглицератдегидрогеназа оба подвержены ингибированию по типу обратной связи со стороны L-триптофана и L-серина, поэтому в эти ферменты можно вводить мутацию, десенсибилизирующую ингибирование по типу обратной связи. Отдельные примеры штаммов, имеющих такую мутацию, включают штамм Е. coli SV164, который несет десенсибилизированную антранилатсинтазу, и штамм-трансформант, полученный путем введения в штамм Е. coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), который содержит мутантный ген serA, кодирующий фермент фосфоглицератдегидрогеназу с десенсибилизированной регуляцией по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых введен опреон триптофана, который содержит ген, кодирующий фермент антранилатсинтазу с десенсибилизированной регуляцией по типу обратной связи (патентные заявки Японии JP 57-71397 А и JP 62-244382 А, патент США 4371614). Кроме того, способность продуцировать L-триптофан может быть придана путем усиления экспрессии гена, кодирующего триптофансинтазу в составе оперонов триптофана trpBA. Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц, и , которые кодируются генами trpA и trpB соответственно. Дополнительно способность продуцировать L-триптофан может быть улучшена путем усиления экспрессии оперона изоцитратлиазомалатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).

Бактерии – продуценты L-пролина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-пролина, согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), который лишен гена ilvA и способен продуцировать L-пролин (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть усовершенствована путем усиления экспрессии одного или более генов, участвующих в биосинтезе L-пролина. Примеры таких генов для бактерий – продуцентов L-пролина, которые являются предпочтительными, включают ген proB, кодирующий фермент глютаматкиназу, для которого регуляция L-пролином по типу обратной связи десенсибилизирована (патент Германии DE Patent 3127361). Дополнительно бактерия согласно настоящему изобретению может быть усовершенствована путем усиления экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, экспортирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примером таких генов могут служить гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Примеры бактерий – продуцентов L-пролина, принадлежащих к роду Escherichia, включают следующие штаммы Е. coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутантные штаммы, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутантные штаммы, описанные Bloom F.R. и соавт. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), и им подобные.

Бактерии – продуценты L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-аргинина, согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и производные от него штаммы, несущие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е. coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358 А1), штамм у таматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР 1170361 А1), и им подобные.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-аргинина, согласно настоящему изобретению включают также штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина, усилена. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглютамилфосфатредуктазу (ArgC), орнитинацетилтрансферазу (ArgJ), N-ацетилглутаматкиназу (ArgB), ацетилорнитинтрансаминазу (ArgD), орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), синтетазу аргининоянтарной кислоты (ArgG), лиазу аргининоянтарной кислоты (ArgH) и карбамоилфосфатсинтетазу.

Бактерии – продуценты L-валина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-валина, согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, которые модифицированы таким образом, что экспрессия оперона ilvGMEDA усилена (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, необходимую для аттенуации, для того чтобы экспрессия опрерона не снижалась вырабатываемым L-валином. Кроме того, ген ilvA в опероне желательно разрушить для того, чтобы активность треониндезаминазы снизилась.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-валина, согласно настоящему изобретению включают также мутантные штаммы, имеющие мутацию фермента аминоацил-т-РНК-синтетазы (патент США 5658766). К примеру, можно использовать штамм Е. coli VL1970, несущий мутацию в гене HeS, который кодирует фермент изолейцин т-РНК синтетазу. Штамм Е. coli VL1970 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 года с инвентарным номером ВКПМВ-4411.

Кроме того, мутантные штаммы, требующие для своего роста присутствия липоевой кислоты и/или отсутствия Н⁺-АТФ-азы, могут быть также использованы в качестве родительских штаммов (заявка РСТ WO 96/06926).

Бактерии – продуценты L-изолейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий – продуцентов L-изолейцина, согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, имеющими мутации устойчивости к 6-диметиламинопурину (патентная заявка Японии JP 5-304969 А), имеющими мутации устойчивости к аналогам изолейцина, таким как тиоизолейцин и гидроксамат изолейцина и мутантными штаммами, имеющими дополнительно устойчивость к DL-этионину и/или гидроксомату аргинина (патентная заявка Японии JP 5-130882 А). Дополнительно в качестве родительских штаммов могут быть использованы рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, участвующие в биосинтезе L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (патентная заявка Японии JP 2-458 А, патент Франции FR 0356739, и патент США 5998178).

2. Способ согласно настоящему изобретению

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в культуральной жидкости и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, например при перемешивании культуральной жидкости на качалке, взбалтывании с аэрацией при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30°С до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды можно доводить аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1-го до 5-и дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 изображено взаимное расположение праймеров b2383 L и b2383 R на плазмиде pACYC184.

На Фиг.2 изображена структура фрагмента ДНК хромосомы, содержащего инактивированный ген b2383.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном b2383.

1. Удаление гена b2383.

Штамм, имеющий делецию гена b2383, был сконструирован с помощью метода, впервые разработанного Datsenko, К.А и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) и названного “Red-driven integration”. Согласно этой методике были сконструированы праймеры для ПЦР b2383 L (SEQ ID NO: 3) и b2383 R (SEQ ID NO: 4), которые гомологичны областям, прилегающим к гену b2383 и к гену, придающему устойчивость к антибиотику хлорамфениколу в матричной плазмиде. В качестве матрицы в ПЦР использовалась плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) с инвентарным номером Х06403 в GenBank/EMBL. Использовался следующий температурный профиль для проверки с помощью ПЦР: денатурация при 95°С в течение трех мин; профиль для двух первых циклов: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; профиль для последних 25-и циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°C; заключительный шаг: 5 мин при 72°С.

Полученный продукт ПЦР-фрагмент длиной 1152 п.о. (Фиг.1) был очищен в агарозном геле и был использован для электропорации в штамм Е. coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46, репликация которой чувствительна к высокой температуре. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены Red гомологичной системы рекомбинации (, , ехо гены) под контролем промотора Р_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки были приготовлены следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli MG1655/pKD46 выращивали при 30°С в LB среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), разводили в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру выращивали с аэрацией при 30°С до достижения ею значений оптической плотности OD₆₀₀0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования их в 100 раз и трехкратной отмывки ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и 100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим хлорамфеникол в концентрации 30 мкг/мл, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение делении гена b2383 с помощью ПЦР.

Мутант с делетированным геном b2383, содержащий ген устойчивости к Cm, был проверен с помощью ПЦР. Локус-специфические праймеры b2383 1 (SEQ ID NO: 5) и b2383 2 (SEQ ID NO: 6) использовались для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для проверки с помощью ПЦР: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма b2383⁺ MG1655, составила 2680 п.о. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 b2383::cat составила 1264 п.о. (Фиг.2).

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е. coli В-3996-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию треонина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat переносили в штамм – продуцент треонина Е. coli VK.PM В-3996 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм В-3996-b2383. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Оба штамма Е. coli, В-3996 и В-3996-b2383, выращивали в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры штаммы выращивали на роторной качалке (250 об/мин при температуре 32°С в течение 18 часов в пробирках объемом 20×200-мм, содержащих 2 мл L-бульона, дополненного 4% глюкозы. Затем в среду для ферментации вносили 0.21 мл (10%) посевного материала. Процесс ферментации проводился в 2мл минимальной среды для ферментации в пробирках объемом 20×200 мм. Клетки выращивали в течение 72-ти часов при температуре 32°C с перемешиванием в режиме 250 об/мин.

После культивирования количество накопленного в среде L-треонина определяли методом бумажной хроматографии, используя подвижную фазу следующего состава: бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовался для визуализации. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали; L-треонин элюировали 0.5%-ным водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментации представлены в Таблице 1.

Использовалась среда для ферментации следующего состава (г/л):

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2-х часов. рН доводили до 7.0. Антибиотики вносили в среду после ее стерилизации.

Как следует из Таблицы 1, штамм В-3996-b2383 вызывает накопление большего количества L-треонина по сравнению со штаммом В-3996.

Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е. coli WC196-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию лизина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент лизина Е. coli WC196 (FERM ВР-5252) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY чтобы получить штамм WC196-b2383.

Оба штамма E. coli, WC196(pCABD2) и WC196-b2383, могут быть выращены в L-среде со стрептомицином (20 мг/л) при температуре 37°С, и 0.3 мл полученной культуры могут быть внесены в 20 мл среды для ферментации, содержащей необходимые компоненты во флаконе объемом 500 мл. Культивирование может быть проведено при температуре 37°С в течение 16-ти часов с использованием возвратного встряхивателя со скоростью взбалтывания 115 об/мин. После культивирования количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде могут быть измерены известным методом (Biotech-analyzer AS210 manufactured by Sakura Seiki Co.), Затем выход L-лизина может быть рассчитан относительно израсходованной глюкозы для каждого из штаммов.

Может быть использована среда для ферментации следующего состава (г/л):

рН можно доводить до 7.0 с помощью КОН и среду можно автоклавировать при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄7H₂O стерилизуют раздельно. Также можно добавить СаСО₃ до конечной концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованный сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов.

Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е. coli JM15(ydeD)-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-цистеина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е. coli JM15(ydeD) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм JM15(ydeD)-b2383.

Штамм Е. coli JM15(ydeD) является производным от штамма Е. coli JM15 (патент США 6218168), который можно трансформировать с помощью фрагмента ДНК, несущего ген ydeD, кодирующий белок мембраны и не участвующий в пути биосинтеза никакой L-аминокислоты (патент США 5972663).

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина описаны подробно в Примере 6 патента США 6218168.

Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е. coli 57-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-лейцина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм – продуцент L-лейцина Е. coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм 57-b2383. Штамм 57 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-7386.

Оба штамма Е. coli, 57 и 57-b2383, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры штаммы могут быть культивированы на возвратной качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 18 часов в тестовых пробирках объемом 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой. Затем в среду для ферментации может быть внесен посевной материал в объеме 0.21 мл (10%). Ферментация может проходить в 2 мл минимальной среды для ферментации в тестовых пробирках объемом 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при температуре 32°С со взбалтыванием в режиме 250 об/мин. Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав жидкой фазы: бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v).

Состав среды для ферментации (г/л) (рН 7.2):

Глюкоза и мел стерилизуются раздельно.

Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е. coli 80-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-гистидина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е. coli 80 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм 80-b2383. Штамм Е. coli 80 был описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 15 октября 1999 года с инвентарным номером ВКПМ В-7270, а затем 12 июля 2004 года было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского договора от 29 сентября 1995 года.

Оба штамма Е. coli, 80 и 80-b2383, могут культивироваться в L-бульоне в течение 6 часов при температуре 29°С. Затем 0.1 мл полученной культуры могут быть внесены в 2 мл среды для ферментации в пробирки объемом 20×200 мм и культивированы в течение 65 часов при температуре 29°С со взбалтыванием на возвратной качалке в режиме 350 об/мин. После культивирования количество гистидина, которое накопилось в среде, может быть измерено с помощью бумажной хроматографии. Бумага может быть экпонирована с использованием подвижной фазы, состоящей из н-бутанола : уксусной кислоты : воды = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован в качестве визуализирующего реагента.

Состав среды для ферментации (г/л) (рН 6.0):

Глюкоза, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуются раздельно. Значение рН доводится до 6.0 перед стерилизацией.

Пример 7. Продукция L-глутамина штаммом Е. coli VL334thrC⁺–b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-глутамина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм – продуцент L-глутамина Е. coli VL334thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм VL334thrC⁺–b2383, Штамм VL334thrC⁺ был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-8961 а затем 8 декабря 2004 года было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского договора от 29 сентября 1995 года.

Оба штамма, VL334thrC⁺ и VL334thrC⁺–b2383, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем петля с клетками может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл со средой для ферментации. Среда для ферментации содержит глюкозу (60 г/л), сульфат аммония (25 г/л), КН₂PO₄ (2 г/л), MgSO₄ (1 г/л), тиамин (0.1 мг/мл), L-изолейцин (70 мкг/мл) и мел (25 г/л). рН должна быть доведена до 7.2. Глюкозу и мел стерилизуют раздельно. Культивирование может быть проведено при температуре 30°С в течение 3-х дней со встряхиванием. После культивирования количество выработанной L-глутаминовой кислоты может быть измерено с помощью ТСХ (состав жидкой фазы: бутанол : уксусная кислота : вода=4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием компонентов в 50%-ном этаноле с 0.5%-ным CdCl₂.

Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е. coli AJ12739-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-фенилаланина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм – продуцент фенилаланина Е. coli АJ12739 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Штамм Е. coli AJ12739 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197, а затем 23 августа 2002 года было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского договора от 29 сентября 1995 года.

Оба штамма, AJ12739-b2383 и AJ12739, могут быть выращены при температуре 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне и 0.3 мл полученной культуры могут быть внесены в 3 мл среды для ферментации в пробирки объемом 20×200 мм и выращены при температуре 37°С в течение 48 часов со встряхиванием на роторной качалке. После культивирования количество фенилаланина, которое накапливается в среде, может быть определено с помощью ТСХ. Могут быть использованы пластинки для ТСХ размером 10×15 см, покрытые силиконовым гелем, содержащим нефлуоресцирующий индикатор (Стоковая Компания Сорбполимер, Краснодар, РФ). Пластинки Sorbfil могут быть проявлены подвижной фазой, содержащей пропан-2-ол : этилацетат : 25% жидкий аммоний : вода = 40:40:7:16 (v/v). 2%-ный раствор нингидрина в ацетоне может быть использован в качестве проявляющего реагента.

Состав среды для ферментации может быть следующим (г/л):

Глюкоза и сульфат магния стерилизуются раздельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов. РН доводится до значения 7.0.

Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е. coli SV164 (pGH5)-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-триптофана фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм – продуцент триптофана Е. coli SV164 (pGH5) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм SV164(pGH5)-b2383. Штамм SV164 имеет в своем составе аллель гена trpE, кодирующий антранилатсинтазу со снятым ингибированием триптофаном по типу обратной связи. Плазмида pGH5 несет мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу со снятым ингибированием серином по типу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) детально описан в патенте США 6180373 и в Европейском патенте 0662143.

Оба штамма, SV164(pGH5)-b2383 и SV164(pGH5), могут быть выращены со встряхиванием при температуре 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (20 мг/мл) в качестве маркера плазмиды pGH5. Полученные культуры в объеме 0.3 мл каждая могут быть внесены в 3 мл среды для ферментации, содержащей тетрациклин (20 мг/мл) в пробирках размером 20×200 мм, и выращены при температуре 37°С в течение 48 часов на роторной качалке в режиме 250 об/мин. После культивирования количество триптофана, накопленное в среде, может быть определено с помощью ТСХ, как описано в Примере 8. Компоненты среды для ферментации перечислены в Таблице 2 и стерилизуются в отдельных группах (А, В, С, D, Е, F, и Н), как показано в таблице, чтобы избежать нежелательных взаимодействий в процессе стерилизации. рН раствора А доводится до 7.1 с помощью аммиака.

Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е. coli 702ilvA-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-пролина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм – продуцент пролина Е. coli 702ilvA с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм 702ilvA-b2383. Штамм 702ilvA был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 18 июля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-8012, а затем 18 мая 2001 года было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского договора от 29 сентября 1995 года.

Оба штамма, 702ilvA и 702ilvA-b2383, могут быть выращены при температуре 37°С в течение 18-24 часов на чашках с L-агаром. Затем штаммы можно культивировать в тех же условиях, которые описаны в Примере 7.

Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е. coli 382-b2383.

Для проверки влияния инактивации гена b2383 на продукцию L-аргинина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 b2383::cat могут быть перенесены в штамм – продуцент аргинина Е. coli 382 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм 382-b2383. Штамм 382 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, а затем 18 мая 2001 года было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского договора от 29 сентября 1995 года.

Оба штамма, 382-b2383 и 382, могут быть выращены со встряхиванием при температуре 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона. Полученные культуры в объеме 0.3 мл каждая могут быть внесены в 3 мл среды для ферментации в пробирки размером 20×200 мм и культивировать при температуре 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После культивирования количество L-аргинина, которое накопилось в среде, может быть определено с помощью бумажной хроматографии, используя подвижную фазу следующего состава: бутанол : уксусная кислота : вода =4:1:1 (v/v). 2%-ный раствор нингидрина в ацетоне может быть использован в качестве проявляющего реагента. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано, L-аргинин может быть элюирован 0.5%-ным водным раствором CdCl₂, а количество аргинина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

Состав среды для ферментации может быть следующим (г/л):

Глюкоза и сульфат магния стерилизуются раздельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов. рН доводится до значения 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Таблица 1
Штамм	OD540	Количество L-треонина, г/л
В-3996	20.5±0.6	23.9±0.6
В-3996-b2383	20.7±0.5	24.5±1.3

Формула изобретения

1. Бактерия-продуцент L-треонина, принадлежащая к роду Escherichia, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген b2383.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген b2383 инактивирован за счет делеции гена b2383 в хромосоме бактерии.

3. Способ получения L-треонина, включающий: выращивание бактерии по любому из пп.1-2 в питательной среде, вызывающее продукцию и накопление L-треонина в культуральной жидкости; и выделение L-треонина из культуральной жидкости.

РИСУНКИ