Патент на изобретение №2333491

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЦЕЛИАКИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии, и может использоваться для диагностики целиакии. Определяют функциональную активность фагоцитарного звена и НСТ-теста. При значении показателей фагоцитарного числа менее 60, фагоцитарного индекса менее 4 и НСТ-теста более 12% диагностируют целиакию. Способ позволяет повысить точность диагностики целиакии, сократить время диагностирования. 5 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”2003. с.7-11. ЧИКОВАНИ И.В. Клинико-морфологические особенности глютеновой энтеропатии у взрослых. Клинические и экспериментальные исследования. №2 (7), 2006, с.110-112. RICHTER JC, NETZER P, COTTAGNOUD P, STUCKI A. Testing strategies and follow-up for coeliac disease in a general internal medicine outpatient department from 2000 to 2005. Swiss Med Wkly. 2006 Nov 11; 136(45-46): 732-8. [он-лайн], [найдено 2007.10.16], найдено из PubMed.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии, и может использоваться при диагностике целиакии.

Хронические заболевания желудочно-кишечного тракта остаются частой формой патологии среди взрослого населения. Целиакия (глютеновая энтеропатия), одно из наиболее распространенных заболеваний органов пищеварения, значительно ухудшает качество жизни (КЖ) больных, приводит к инвалидизации, а при развитии некоторых онкологических осложнений является одной из причин смерти больных с гастроэнтерологической патологией.

Определенные трудности возникают при необходимости распознать целиакию среди взрослого населения. В этих возрастных группах болезнь протекает скрытно, атипично, характерные симптомы могут быть слабовыраженными или отсутствовать. В последние десятилетия мнение как о редком заболевании изменилось в связи с совершенствованием диагностики, повышением уровня знаний врачей о целиакии, а также увеличением содержания белка в зерне в результате селекции по выведению новых сортов злаковых культур.

Задачей изобретения является повышение эффективности диагностики целиакии за счет специфичности способа, а также повышения его точности и сокращения времени диагностирования.

Поставленная задача решается тем, что оценивают морфометрические показатели слизистой оболочки тонкой кишки и эндоскопические изменения желудочно-кишечного тракта, а также иммунный статус организма путем определения антиглиадиновых антител и определения функциональной активности фагоцитарного звена и НСТ-теста и при значении показателей фагоцитарного числа менее 60, фагоцитарного индекса менее 4 и НСТ-теста более 12% диагностируют целиакию.

Способ диагностики осуществляется следующим образом.

1. При эндоскопическом исследовании выполняется прицельная биопсия из трех отделов слизистой оболочки (СО) 12-перстной кишки (ДПК) – бульбарного, верхней горизонтальной ветви и нижней горизонтальной ветви, с обязательной маркировкой материала. Материал фиксируется в 10% растворе нейтрального формалина в течение 12-24 часов, заливается в парафин по общепринятой методике под контролем правильности ориентации биоптата для исключения возможности поперечных или тангенциальных срезов. Изготавливаются серийные парафиновые срезы (от 20 до 30 срезов с каждого биоптата) толщиной 3-5 мкм.

Гистологические срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, альциановым синим при рН 1,0; толуидиновым синим. Проводится реакция ШИК, окраска по Романовскому-Гимзе, обработка солями серебра по Гримелиусу.

По классификации М. Marsh (1995) выделяется четыре стадии целиакии: 1-я стадия – инфильтративная (выраженная лимфоцитарная инфильтрация эпителия, строение СО сохранено); 2-я стадия – гиперпластическая (углубление крипт и лимфоцитарная инфильтрация эпителия ворсинок и крипт); 3-я стадия – деструктивная (истончение СО кишки с резким укорочением ворсинок и удлинением крипт, обильная лимфоплазмоцитарная инфильтрация собственной пластинки и покровного эпителия (А – частичная атрофия ворсинок, В – субтотальная, С – тотальная)); 4-я стадия – гипопластическая или атрофическая (сохранение атрофических изменений несмотря на соблюдение безглютеновой диеты).

При морфометрическом исследовании изучается комплекс линейных и морфофункциональных показателей. Проводится количественная оценка: толщины СО, количества и высоты ворсинок, ширины ворсинок, глубины и ширины крипт, высоты энтероцитов ворсинок и крипт, с вычислением коэффициентов: соотношений высоты ворсинок к глубине крипт (ВВ/ГК) и высоты энтероцитов ворсинок к высоте энтероцитов крипт (ВЭВ/ВЭК). Исследуется количественное содержание в покровном эпителии ворсин и крипт – ВЭЛ, бокаловидных клеток, клеток Панета, апудоцитов; в собственной пластинке – лимфоцитов, плазматических клеток, нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, макрофагов, тучных клеток. Полуколичественно по балльной системе оценивается: степень выраженности эрозий; характер фиброза; нарушения кровообращения – отек стромы и полнокровие сосудов; характер кровоизлияний; наличие бруннеровых желез в собственной пластинке СО. Линейные показатели СО 12-пк при целиакии (по данным разных авторов)

Гистологическое, гистохимическое и морфометрическое исследования проводятся на микроскопе Микмед-1. Морфометрическое исследование выполняется с помощью окуляр- и объект-микрометров «Reichert», комбинированной окулярной стереометрической сетки, а также демонстрационной насадки к микроскопу «Ампливал» со стандартной масштабной сеткой по методике.

2. Определение антител к глиадину (АГА) IgA и IgG проводится по принципу двухсайтового (сэндвич) иммуноферментного анализа (000 «Хема-Медика», Москва / Xema-Medica Co. Ltd.) с точностью измерения ±1% или ±0,005. Принцип метода заключается в реакции антиген-антитело, где антигеном выступает глиадин. В лунки микропланшета, на поверхности которых адсорбирован антиген, вносится исследуемый образец. Антитела из образца связываются с антигеном на поверхности лунки. Несвязавшийся материал удаляется отмывкой. В лунки вносят вторые антитела к Ig человека, меченные пероксидазой. После повторной отмывки активность фермента, связанного с поверхностью лунки микропланшета, проявляется и измеряется добавлением хромоген-субстратной смеси 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина, стоп-раствора 5% серной кислоты и фотометрией при 450 нм. Цветная реакция останавливается и происходит изменение цвета с голубого на желтый. Интенсивность цветной реакции прямо пропорциональна количеству антител в сыворотке. Расчет результатов производится по калибровочным графикам с определением концентрации AGA в опытных образцах, соответствующих полученному значению оптической плотности. Нормальными значениями IgA и IgG являются менее 25,0 Ед./мл.

3. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов. Фагоцитоз является главным механизмом естественной резистентности организма, а также первоначальным звеном индуцированного специфического иммунного ответа. Известно, что снижение функции нейтрофилов приводит к персистированию антигенов, нарушению элиминации антигенов и иммунных комплексов.

Сущность метода заключается в способности зрелых нейтрофилов фагоцитировать и перерабатывать антигены.

Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,2 мл крови, чтобы диаметр толстой капли не превышал 1 см. Вносят в каплю крови 0,1 мл взвеси стафилококков S. ablus (2×109 клеток в 1 мл) и тщательно перемешивают. Помещают на предметное стекло во влажную чашку Петри и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин.

Учет результатов реакции. Высушить каплю на воздухе, установив стекло в вертикальном положении, нанести несколько капель дистиллированной воды и через 3 мин осторожно слить образовавшуюся гемолизированную массу. Препарат высушить, зафиксировать смесью Никифорова (15 мин), окрасить по Романовскому-Гимзе. Эритроциты окрашиваются в желтовато-красный цвет. У лейкоцитов ядра и фаготированные микробные клетки окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма – в голубовато-синий. Учет фагоцитарной активности проводят, определяя процент нейтрофилов с фагоцитированным материалом – фагоцитарное число и количество поглощенных частиц из расчета на один нейтрофил-фагоцитарный индекс. При микроскопическом исследовании окрашенных препаратов следует подсчитать 200 нейтрофилов.

Оценка метода. В норме фагоцитарный индекс составляет – от 3 до 5, фагоцитарное число 65-70%.

4. Определение НСТ-теста.

Сущность метода заключается в способности зрелых нейтрофилов фагоцитировать бесцветный краситель нитросиний тетразолий (НСТ) и затем восстанавливать его под влиянием лизосомального фермента НАДФ- оксидазы в нерастворимый фармазан темно-синего цвета. Фагоцитоз НСТ зависит от состояния оболочки нейтрофилов и повышается при повреждении антигенами мембранной оболочки клетки, стимуляции активности окислительно-восстановительных процессов и является показателем клеточного метаболизма.

Постановка реакции. 0,1 мл гепаринизированной крови, обогащенной лейкоцитами, смешивают с равным количеством раствора НСТ в фосфатном буфере. Смесь инкубируют в воздушном термостате при 37°С в течение 20 мин, а затем при комнатной температуре 20 мин. После окончания инкубации делают мазки на предметном стекле, окрашивают по Паппенгейму-Крюкову.

Учет результатов реакции. При микроскопическом исследовании окрашенных препаратов следует подсчитать 100 нейтрофилов. НСТ-позитивными считают клетки с темно-синими зернами фармазана. Результат теста выражают в процентах, определяя количество окрашенных нейтрофилов и количество НСТ-позитивных нейтофилов. В норме у здоровых людей 4-12% нейтрофилов способны восстанавливать НСТ.

Отличительными существенными признаками заявляемого способа являются: дополнительное определение функциональной активности фагоцитарного звена и микробицидной активности нейтрофилов и при значении показателей фагоцитарного числа менее 60, фагоцитарного индекса менее 4 ед. и НСТ-теста более 12% диагностируют целиакию. Таким образом, сравнительная простота, воспроизводимость результатов, высокая чувствительность позволяют рекомендовать методы оценки фагоцитарной активности и НСТ-теста в лабораторной практике как способ диагностики целиакии.

Отличительные существенные признаки заявляемого способа являются новыми и позволяют повысить точность способа и сократить время диагностики целиакии в отличие от способа-прототипа.

Патологические реакции на иммунные комплексы могут быть обусловлены функциональными дефектами фагоцитарной системы при генетически детерминированных заболеваниях. Иммунные комплексы, накапливаясь, могут обусловливать патогенные реакции. При фиксации ЦИК на Fc-рецепторы нейтрофилов происходит активация фагоцитоза – это приводит к внутриклеточному распаду ИК, но выделяющиеся из активированной клетки ферменты могут оказывать воздействие на клеточные и тканевые структуры. Такой механизм активации нейтрофилов с высвобождением лизосомальных ферментов играет важную патогенетическую роль в повреждении клеточных и тканевых структур. [Долгих В.Т. Основы иммунопатологии. – Н.Новгород. – 1998. – 37-175].

Впервые нами предложено использование в качестве дополнительного иммунологического теста для диагностики целиакии определение функциональной активности фагоцитарного звена и НСТ-теста.

Приводим примеры из клинической практики, иллюстрирующие заявляемый способ.

Пример 1. Больная А., 22 лет. И/б №7024.

Пациентка поступила в клинику 20.04.2006 г. с жалобами на ноющие боли в животе разлитого характера, изжогу, вздутие живота, урчание в животе, диарею стул 2-3 раза в день, кашицеобразный, 3 тип согласно Бристольской шкале. Проведено обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, иммунологическое исследование крови (определение АГА, ФЧ, ФИ, НСТ-тест).

На основании результатов эндоскопического, морфометрического, иммунологического исследования путем определение функциональной активности фагоцитарного звена и микробицидной активности и при значении показателей фагоцитарного числа менее 45, фагоцитарного индекса менее 2,5 и НСТ-теста более 35% диагностирована целиакия. Результаты обследования представлены в таблице 1.

Пример 2. Больной М., 23 лет. И/б №6996.

Пациент поступил в клинику 15.05.2006 г. с жалобами на ноющие боли в эпигастрии, отрыжку кислым, вздутие живота, урчание в животе, частые пневмонии в анамнезе. Проведено обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, иммунологическое исследование крови (определение АГА, ФЧ, ФИ, НСТ-тест).

На основании результатов эндоскопического, морфометрического, иммунологического исследования путем определение функциональной активности фагоцитарного звена и микробицидной активности и при значении показателей фагоцитарного числа менее 42, фагоцитарного индекса менее 2,9 и НСТ-теста более 42% диагностирована целиакия. Результаты обследования представлены в таблице 2.

Пример 3. Больная С., 43 лет. И/б №7085.

Пациентка поступила в клинику 22.05.2006 г. с жалобами на ноющие боли по ходу кишечника, вздутие, запоры, пищевые аллергические реакции. Проведено обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, иммунологическое исследование крови (определение АГА, ФЧ, ФИ, НСТ-тест).

На основании результатов эндоскопического, морфометрического, иммунологического исследования путем определение функциональной активности фагоцитарного звена и микробицидной активности и при значении показателей фагоцитарного числа менее 48, фагоцитарного индекса менее 3,0 и НСТ-теста более 48% диагностирована целиакия. Результаты обследования представлены в таблице 3.

У всех больных из основной группы значении показателей фагоцитарного числа менее 60, фагоцитарного индекса менее 4 и НСТ-теста более 12%.

Примеры по способу-прототипу.

Пример 1. Больной В. 41. И/б №7218.

Пациент поступил в клинику 10.05.2004 г. с жалобами на ноющие боли в собственно эпигастральной области, нарушение стула по типу запоров, кожные высыпания, кожный зуд. Проведено обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, иммунологическое исследование крови (определение АГА).

На основании результатов эндоскопического, морфометрического, иммунологического исследования был поставлен предварительный диагноз целиакии. Через 6 месяцев больному было проведено повторное обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Результаты обследования представлены в таблице 4.

На основании результатов эндоскопического и повторного гистоморфологического был поставлен диагноз целиакия.

Пример 2. Больной Д. 43. И/б №7852

Пациентка поступила в клинику 12.10.2004 г. с жалобами на ноющие боли в собственно эпигастральной области, нарушение стула по типу диареи, слабость, раздражительность, плохой сон. Проведено обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, иммунологическое исследование крови (определение АГА).

На основании результатов эндоскопического, морфометрического, иммунологического исследования был поставлен предварительный диагноз целиакии. Через 6 месяцев после соблюдения аглютеновой диеты больной было проведено повторное обследование: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, гистоморфологическое исследование биоптата слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Результаты обследования представлены в таблице 5.

По заявляемому способу было обследовано 50 и по способу-прототипу – 100 человек, соотношение мужчин и женщин составило 1:1, средний возраст больных составил 30,5 лет.

Больные были распределены методом случайной выборки на две группы: основная, в которой для верификации диагноза целиакии были использованы следующие диагностические методы: общеклиническое обследование, морфологическое исследование слизистой оболочки тонкой кишки, определение антиглиадиновых антител классов А и G, определение функциональной активности фагоцитарного звена и микробицидной активности нейтрофилов (50 человек), и группа по способу-прототипу, в которой были использованы: общеклиническое обследование, морфологическое исследование слизистой тонкой кишки и определение антиглиадиновых антител классов А и G (100 человек).

В исследовании оценивались результаты морфометрических показателей, эндоскопической картины желудочно-кишечного тракта и показателей иммунного статуса путем определения антиглиадиновых антител классов А и G.

По результатам проведенного исследования в основной группе диагноз целиакия установлен у 48 больных из 50 обследованных, т.е. в 96,0% случаев; в группе сравнения – у 80 человека из 100 обследованных, т.е. в 80,0% случаев. Таким образом, заявляемый способ повышает точность диагностики целиакии на 16,0%. Специфичность заявляемого способа обусловлена тем, что у больных целиакией всегда значения показателей фагоцитарного числа менее 60, фагоцитарного индекса менее 4 и НСТ-теста более 12%, что отражает один из ведущих механизмов патогенеза данной патологии в условиях генетического дефекта HLA-системы организма. В группе сравнения – из 100 обследованных у 20 человек с сомнительными клиническими случаями возникла необходимость проведения повторного исследования через 6 месяцев, т.е. в 20,0% случаев диагноз целиакии был установлен после повторного обследования. Сокращение длительности диагностики по заявляемому способу связано с отсутствием необходимости повторного гистоморфологического исследования.

Заявляемый способ диагностики целиакии по сравнению со способом-прототипом является специфичным, повышает точность на 16,0% и сокращает время диагностирования.

Формула изобретения

Способ диагностики целиакии у взрослых, заключающийся в оценке иммунологических показателей, отличающийся тем, что определяют функциональную активность фагоцитарного звена и НСТ-теста и при значении показателей фагоцитарного числа менее 60, фагоцитарного индекса менее 4 и НСТ-теста более 12% диагностируют целиакию.