Патент на изобретение №2332748

(54) МАСС-СПЕКТРОМЕТР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ

(57) Реферат:

Изобретение относится к масс-спектрометрии и может быть использовано при определении массы макромолекул. Масс-спектрометр содержит держатель с анализируемым веществом, средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор и систему детектирования. Масс-анализатор связан с держателем с анализируемым веществом, а система детектирования выполнена на основе матрицы микромеханических кантилеверов с возможностью определения момента времени взаимодействия и точки контакта ускоренной макромолекулы с поверхностью лепестка микромеханического кантилевера, приводящего к передаче импульса макромолекулы лепестку микромеханического кантилевера и последующему отклонению лепестка на расстояние, определяемое массой и энергией макромолекулы. При этом система детектирования реализована в составе последовательно оптически связанных источника излучения, коллимирующей оптики, матрицы микромеханических кантилеверов, проектирующей оптики и фотоприемника, а матрица микромеханических кантилеверов в ней выполнена в виде подложки детектора, на которой установлены микромеханические кантилеверы, при этом микромеханический кантилевер выполнен в составе ножки, кронштейна, отражающего слоя. Матрица микромеханических кантилеверов выполнена многоэлементной. Технический результат: повышение интегральной чувствительности в широком диапазоне масс макромолекул. 12 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к приборам для исследования материалов или объектов, а именно к масс-спектрометрам, и может быть использовано, в частности, для определения массы макромолекул, включая белки, большие пептиды, длинные ДНК-фрагменты и полимеры.

Известен масс-спектрометр для исследования макромолекул (патент на изобретение США №5077470, МПК: 5 Н01J 49/04), содержащий держатель с анализируемым веществом, средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор, масс-анализатор и систему детектирования, при этом средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор выполнено в виде импульсного генератора пучка частиц, ионизующего макромолекулы анализируемого вещества посредством повторяющегося облучения до получения ионов макромолекул или фрагментов ионов, обладающих способностью к введению их в масс-анализатор для сепарирования в соответствии с отношением масса/заряд, связанная с масс-анализатором система детектирования, идентифицирующая количество тех или иных сепарированных ионов, выполнена с возможностью перенастройки посредством перенастраивающего сигнала и чтения посредством считывающего сигнала для определения полного времяпролетного масс-спектра, а также масс-спектрометр снабжен средством синхронизации для контроля частоты импульса пучка частиц и времен подачи перенастраивающего и считывающего сигналов относительно начала импульса пучка частиц.

К недостаткам данного технического решения относится низкая интегральная чувствительность в широком диапазоне масс макромолекул. Недостаток обусловлен конструктивным выполнением масс-спектрометра. В данном масс-спектрометре использован детектор на основе микроканальной пластины, чувствительность которого существенно зависит от скорости иона, то есть ионизованной макромолекулы. При заданной энергии ионов (Е), определяющейся величиной ускоряющего напряжения, скорость иона (v) уменьшается с увеличением его массы (m), поскольку E=mv²/2. Поэтому для крупных макромолекул имеет место падение чувствительности детектора и, следовательно, масс-спектрометра.

В качестве ближайшего технического решения известен масс-спектрометр для исследования макромолекул (патент на изобретение США №5640010, МПК: 6 Н01J 49/40), содержащий держатель с анализируемым веществом (в виде конденсированного раствора), средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор, масс-анализатор и систему детектирования, при этом средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор выполнено в виде средства для испарения и заряда макромолекул из конденсированного раствора и размещено в откачиваемом приемнике (вакуумной камере) для испарения и заряда макромолекул при помощи указанного средства, масс-анализатор выполнен в виде средства для ускорения заряженных макромолекул, размещенного в указанном откачиваемом приемнике, и высоковольтного источника питания, электрически соединенного со средством для ускорения заряженных макромолекул, причем указанный откачиваемый приемник выполнен с возможностью осуществления им функции разделения ускоренных заряженных макромолекул в соответствии с их скоростями (отношением масса/заряд), а размещенная в указанном вакуумном приемнике система детектирования выполнена на основе криогенного детектора частиц в составе, по крайней мере, одного поглотителя и, по крайней мере, одного сенсора фононов, с возможностью определения времени взаимодействия в точке контакта ускоренной макромолекулы с поверхностью детектора, обуславливающего поглощение кинетической энергии контактирующих макромолекул и преобразование ее в фононы, возбуждаемые в поглотителе и вызывающие при поглощении их сенсором фононов возникновение электрического сигнала, в составе системы детектирования выполнена механическая заслонка, состоящая из вращающегося диска и обеспечивающая попадание на криогенный детектор частиц макромолекул определенной величины, предусилитель сигнала криогенного детектора частиц, а также криостат с холодной трубкой, с которой термически связан криогенный детектор частиц.

К недостаткам приведенного технического решения относится низкая интегральная чувствительность в широком диапазоне масс макромолекул, а также высокая стоимость прибора и значительные эксплуатационные расходы. Указанные недостатки обусловлены конструктивным выполнением масс-спектрометра. Он отличается высокой стоимостью и сложностью в эксплуатации вследствие наличия сверхпроводящих многоэлементных криогенных детекторов, требующих рабочих температур порядка одной десятой градуса Кельвина. Малая площадь детектора (суммарная площадь 16 многоэлементных криогенных детекторов составляет 0,64 мм²), является причиной низкой интегральной чувствительности в широком диапазоне масс макромолекул. Прибор эффективен в случае крупных макромолекул, с массой, превосходящей 10 кДа, поскольку на эффективности криодетектора не проявляется наличие такого лимитирующего чувствительность фактора, как влияние величины скорости (массы) иона, и неэффективен в противном случае в результате наличия другого лимитирующего фактора. Для макромолекул с массой меньше 10 кДа малая площадь детектора является существенным лимитирующим чувствительность фактором. Для них предпочтительнее использовать детектор на основе микроканальной пластины, который легко изготовить требуемых размеров и который характеризуется отсутствием такого лимитирующего фактора, как влияние площади детектора. Малая площадь детектора является основной причиной пониженной эффективности криодетектора, поскольку именно размеры детектора не позволяют регистрировать макромолекулы с малой массой, которые, ускоряясь в поле, отклоняются им и не взаимодействуют с системой детектирования, минуя ее. Поэтому при исследовании макромолекул с массой меньше 10 кДа его интегральная чувствительность существенно ниже, чем в масс-спектрометре с датчиком на основе микроканальной пластины (см. вышеприведенное техническое решение).

Таким образом, вышеприведенные технические решения обладают общим недостатком – низкой интегральной чувствительностью. В первом случае недостаток обусловлен проявлением такого лимитирующего фактора, как влияние скорости (массы) иона, в результате чего чувствительность в диапазоне крупных макромолекул существенно снижается. Во втором случае недостаток обусловлен проявлением такого лимитирующего фактора, как влиянием величины площади детектора, в результате чего чувствительность снижается в диапазоне малых макромолекул.

Техническим результатом изобретения является повышение интегральной чувствительности в широком диапазоне масс макромолекул, снижение стоимости прибора и эксплуатационных расходов.

Технический результат достигают тем, что в масс-спектрометре для исследования макромолекул, содержащем держатель с анализируемым веществом, связанное с ним средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор, масс-анализатор и связанную с масс-анализатором систему детектирования, масс-анализатор связан с держателем с анализируемым веществом, система детектирования выполнена на основе матрицы микромеханических кантилеверов с возможностью определения момента времени взаимодействия и точки контакта ускоренной макромолекулы с поверхностью лепестка микромеханического кантилевера, приводящего к передаче импульса макромолекулы лепестку микромеханического кантилевера и последующему отклонению лепестка на расстояние, определяемое массой и энергией макромолекулы.

В масс-спектрометре для регистрации отклонения лепестка микромеханического кантилевера система детектирования выполнена в составе последовательно оптически связанных источника излучения, коллимирующей оптики, матрицы микромеханических кантилеверов, проектирующей оптики и фотоприемника.

В масс-спектрометре для регистрации отклонения лепестка микромеханического кантилевера система детектирования выполнена в составе матрицы микромеханических кантилеверов и электрически связанной с ней системы считывания, при этом микромеханические кантилеверы снабжены элементами считывания в интегральном исполнении с микромеханическими кантилеверами с принципом действия, основанным на измерении емкости лепестка относительно входа элемента считывания.

В масс-спектрометре микромеханический кантилевер выполнен с конструктивными параметрами, определяющими возможность наличия регистрируемого отклонения лепестка.

Матрица микромеханических кантилеверов выполнена многоэлементной.

В масс-спектрометре матрица микромеханических кантилеверов выполнена в виде подложки детектора, на которой установлены микромеханические кантилеверы, при этом микромеханический кантилевер выполнен в составе ножки, кронштейна, отражающего слоя, основания лепестка; ножка выполнена на подложке детектора с возможностью расположения микромеханического кантилевера над ее поверхностью; с ножкой связан кронштейн, который пространственно расположен над поверхностью подложки детектора; кронштейн соединен с основанием лепестка, которое также расположено над поверхностью подложки детектора; на основание лепестка нанесен отражающий слой, образующий с основанием лепестка в совокупности лепесток.

В масс-спектрометре матрица микромеханических кантилеверов выполнена в виде подложки детектора, обкладки конденсатора подложки детектора и микромеханических кантилеверов, размещенных на подложке детектора, при этом микромеханический кантилевер выполнен в составе ножки, кронштейна, основания лепестка, обкладки конденсатора на микромеханическом кантилевере; ножка выполнена на подложке детектора с возможностью расположения микромеханического кантилевера над ее поверхностью; с ножкой связан кронштейн, который пространственно расположен над поверхностью подложки детектора; кронштейн соединен с основанием лепестка, которое также расположено над поверхностью подложки детектора; верхние части основания лепестка и кронштейна, а также вертикальная часть ножки с одной стороны покрыты сплошным проводящим слоем, представляющим собой обкладку конденсатора на микромеханическом кантилевере, при этом лепесток образован основанием лепестка с нанесенным на него проводящим слоем; обкладки конденсатора подложки детектора и микромеханического кантилевера, ножка выполнены с достижением электрической развязки между указанными обкладками; подложка детектора заземлена.

В масс-спектрометре держатель с анализируемым веществом выполнен в виде подложки, на поверхности которой размещена матрица с анализируемым веществом, а на противоположной стороне выполнен электрод для подачи напряжения, и через который электрически осуществлена связь с масс-анализатором, а другая связь с масс-анализатором реализована посредством потока ионов исследуемых макромолекул, держатель с анализируемым веществом размещен в вакуумной камере масс-анализатора.

В масс-спектрометре средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор выполнено в виде импульсного лазера и фокусирующей оптики, оптически последовательно связанных с держателем с анализируемым веществом с возможностью подачи излучения на анализируемое вещество, извлечения его из матрицы в виде ионов или фрагментов ионов.

В масс-спектрометре масс-анализатор выполнен в виде вакуумной камеры, размещенных в ней двух сетчатых электродов, между которыми размещен сепаратор, представляющий собой дрейфовое пространство с отсутствием в нем поля, ограниченное со стороны электродов металлическими сетками, не препятствующими пролету ионов, а по бокам сплошным металлическим экраном, при этом первый сетчатый электрод для образования первого ускоряющего промежутка установлен на расстоянии от держателя с анализируемым веществом, первый сетчатый электрод выполнен в виде двух сеток, расположенных параллельно, с зазором между ними для образования промежутка с отсутствием в нем поля, для образования второго ускоряющего промежутка сепаратор размещен на расстоянии от первого сетчатого электрода, второй сетчатый электрод установлен с возможностью деления пространства между сепаратором и матрицей микромеханических кантилеверов системы детектирования сепарированных ионов в соответствии с отношением заряд/масса, для подачи напряжения на сетчатые электроды и держатель с анализируемым веществом выполнен источник напряжения со средствами синхронизации времени подачи сигналов; масс-анализатор связан с системой детектирования посредством потока ионов макромолекул, сепарированных в соответствии с отношением заряд/масса.

Сущность изобретения поясняется нижеследующим описанием и чертежами. На Фиг.1 представлена блок-схема масс-спектрометра для исследования макромолекул а) и временная последовательность подачи сигналов на электроды б), где 1 – источник излучения, 2 – коллимирующая оптика, 3 – матрица микромеханических кантилеверов, 4 – проектирующая оптика, 5 – фотоприемник, 6 – импульсный лазер, 7 – фокусирующая оптика, 8 – подложка, 9 – матрица с анализируемым веществом, 10 – источник напряжения, 11 – электрод, 12 – первый сетчатый электрод, 13 – второй сетчатый электрод, 14 – сепаратор, 15 – вакуумная камера. На Фиг.2 дана блок-схема системы детектирования на основе оптической регистрации колебаний, возникающих в матрице микромеханических кантилеверов, где 1 – источник излучения, 2 – коллимирующая оптика, 3 – матрица микромеханических кантилеверов, 4 – проектирующая оптика, 5 – фотоприемник, 16 – экран. На Фиг.3 схематически изображен фрагмент матрицы микромеханических кантилеверов, используемой в системе детектирования на основе оптической регистрации колебаний кантилевера, где 17 – микромеханический кантилевер, 18 – подложка детектора, 19 – основание лепестка, 20 – кронштейн, 21 – ножка, 22 – отражающий слой. На Фиг.4 схематически изображен фрагмент матрицы микромеханических кантилеверов, используемой в системе детектирования на основе емкостной регистрации колебаний кантилевера, где 17 – микромеханический кантилевер, 18 – подложка детектора, 19 – основание лепестка, 20 – кронштейн, 21 – ножка, 23 – обкладка конденсатора на подложке детектора, 24 – обкладка конденсатора на микромеханическом кантилевере, 25 – контактное окно.

В предлагаемом масс-спектрометре для исследования макромолекул (Фиг.1) достижение технического результата базируется на использовании в системе детектирования (например, Фиг.2) в качестве детектора матрицы микромеханических кантилеверов (Фиг.3 или Фиг.4).

Нижеприведенная оценка возможности регистрации единичных макромолекул посредством использования микромеханических кантилеверов свидетельствует о возможности реализации масс-спектрометра с системой детектирования на основе матрицы микромеханических кантилеверов с достижением указанного технического результата.

Рассмотрим микромеханический кантилевер (Фиг.3) как гармонический осциллятор с массой М и резонансной частотой ₀, находящийся в начальный момент времени в состоянии покоя. Для случая упругого столкновения с молекулой массой m и энергией Е движение микромеханического кантилевера определяется выражением

x=Bsin₀t,

где B=v₀/₀, v₀ – начальная скорость лепестка микромеханического кантилевера, представляющего собой основание лепестка 19 с лежащим на нем отражающим слоем 22 (Фиг.3). Максимальное отклонение лепестка микромеханического кантилевера x_мак=В.

Из закона сохранения импульса v₀ определяется выражением

v₀=(2Em)^1/2/M.

Масса лепестка микромеханического кантилевера, определяемая главным образом основанием лепестка 19, например, с площадью 50×50 мкм², толщиной 0,5 мкм и удельной плотностью материала 2×10³ кг/м³, составляет 2,5×10^-12 кг. Типичные значения ₀ для микромеханических кантилеверов лежат в интервале 10²÷10⁴ с^-1 (М.Vavghese, R.Amantea, S.Senturia «Resistive Damping of Pulse – Sensed Capacitive Position Sensors», International Conference on Solid – State Actuators, June 16-19, 1997, p.p.1121-1124).

Расстояние, на которое происходит смещение (отклонение) лепестка микромеханического кантилевера, определяется массой и энергией макромолекулы. Для молекулы с массой 10⁵ дальтон (m=1,6×10^-22 кг) и энергией 20 кэВ максимальное отклонение лепестка микромеханического кантилевера x_мак составляет порядка 2×10^-9 м.

Такое отклонение регистрируется известными оптическими схемами, в частности, оптическими схемами атомно-силовых микроскопов, которые обеспечивают регистрацию отклонения микромеханического кантилевера с точностью порядка 10^-11 м.

Детектор на основе матрицы микромеханических кантилеверов позволяет регистрировать единичные ионы, начиная с достаточно малых масс. Известно, что основной интерес представляет диапазон масс больше 1000 Да. При использовании в системе детектирования микромеханических кантилеверов, например, с площадью основания лепестка 20×20 мкм², толщиной 0,2 мкм, с удельной плотностью материала основания лепестка, например, из SiC, равной 3,2×10³ кг, то при массе лепестка, определяемой в основном основанием лепестка 19 и составляющей 2,5×10^-13 кг, ускоряющем поле масс-анализатора (Фиг.1) 20 кэВ, кинетической энергии макромолекулы, составляющей 3,2×10^-15 Дж, использовании оптической схемы с разрешением порядка 4×10^-11 м и ₀ порядка 10³ с^-1, достигаемая чувствительность масс-спектрометра будет не хуже 1,5×10^-26 кг, то есть порядка 50 Да. Таким образом, предлагаемый масс-спектрометр обладает высокой интегральной чувствительностью в указанном диапазоне масс.

Возможность наличия регистрируемого отклонения лепестка микромеханического кантилевера на то или иное расстояние при взаимодействии с макромолекулой определяется также конструктивными параметрами самого микромеханического кантилевера. Значения конструктивных параметров непосредственно связаны с величиной резонансной частоты ₀. Реализация микромеханических кантилеверов с требуемой для регистрации отклонения резонансной частотой ₀, лежащей в интервале 10²÷10⁴ с^-1, осуществляется путем оптимизации конструктивных параметров микромеханического кантилевера, например, таких как толщина и высота ножки 21 (Фиг.3 и 4). Подход к реализации микромеханических кантилеверов с требуемой резонансной частотой ₀, присущей каждому кантилеверу путем оптимизации его геометрических параметров, позволяет реализовывать матрицы микромеханических кантилеверов, например, форматом более, чем 100×100 без потери чувствительности в отношении каждого отдельно взятого кантилевера.

Предлагаемый масс-спектрометр для исследования макромолекул (Фиг.1а), например, в случае выполнения системы детектирования на основе оптической регистрации отклонений микромеханических кантилеверов содержит следующие основные конструктивные элементы: источник излучения 1, коллимирующая оптика 2, матрица микромеханических кантилеверов 3, проектирующая оптика 4, фотоприемник 5, импульсный лазер 6, фокусирующая оптика 7, подложка 8, матрица с анализируемым веществом 9, источник напряжения 10, электрод 11, первый сетчатый электрод 12, второй сетчатый электрод 13, сепаратор 14, вакуумную камеру 15.

В предлагаемом изобретении реализован времяпролетный масс-спектрометр, собранный по схеме Уайли-Макларена (W.C.Miley, I.H.McLaren «Time-of-flight spectrometer with improved resolution» Rev. Sci. Instrum., 1955, v.26, N.12, p.p.1150-1157) (без компенсации начального разброса ионов по скоростям), но возможна также и реализация без каких-либо дополнительных переделок времяпролетного масс-спектрометра, собранного по схеме рефлектрона, позволяющая компенсировать распределение ионов по скоростям (В.И.Каратаев, Б.А.Мамырин, Д.И.Шмикк. «Новый принцип фокусировки ионных пакетов во времяпролетных масс-спектрометрах» ЖТФ, 1971, 41. №7, с.с.1498-1501).

Масс-спектрометр для исследования макромолекул в общем случае (без конкретизации выполнения системы детектирования) содержит функциональные узлы: держатель с анализируемым веществом, связанное с ним средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор, связанный с держателем с анализируемым веществом масс-анализатор и связанную с масс-анализатором систему детектирования. Система детектирования выполнена на основе матрицы микромеханических кантилеверов. Держатель с анализируемым веществом и матрица микромеханических кантилеверов системы детектирования размещены в вакуумной камере 15 масс-анализатора.

Держатель с анализируемым веществом выполнен в составе (Фиг.1а) подложки 8, на поверхности которой размещена матрица с анализируемым веществом 9, а на противоположной стороне выполнен электрод 11 для подачи напряжения. В качестве подложки 8 используют, например, металлическую пластину, покрытую золотом, выполняющую при этом также и функцию электрода 11 для подачи на него напряжения от источника напряжения 10. Матрица с анализируемым веществом 9, например, представляет собой кристаллическую решетку светочувствительного кристаллораствора (цианистая кислота или циано-4-гидрокси-цианистая кислота), в котором в соотношении 10⁴:1 растворены макромолекулы. В частности, предлагаемый масс-спектрометр может быть использован для исследования ДНК-последовательности, например, такой, как цепочка ДНК-последовательностей, которая определяется следующими последовательностями ДНК-альфабет: аденина, гуанина, тимина, цитозина. В качестве матрицы с анализируемым веществом 9 может быть и другая исследуемая проба с другими макромолекулами белков, полипептидов, ДНК-фрагментами и полимерами. Держатель с анализируемым веществом связан с масс-анализатором посредством электрического соединения электрода 11 и источника напряжения 10, а также связан посредством потока ионов исследуемых макромолекул, который поступает в масс-анализатор. Поток ионов макромолекул формируется посредством их выброса из матрицы с анализируемым веществом 9 за счет подачи на электрод 11 высоковольтного потенциала от источника напряжения 11 и излучения, исходящего от средства для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор.

Средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор выполнено в виде импульсного лазера 6 и фокусирующей оптики 7, оптически последовательно связанных с держателем с анализируемым веществом, с возможностью подачи излучения на анализируемое вещество, извлечения его из матрицы в виде ионов или фрагментов ионов. Импульсный лазер 6 является источником излучения, воздействующего на матрицу с анализируемым веществом 9 для его извлечения и ионизации с целью подачи в масс-анализатор. Для достижения эффективного воздействия лазерного излучения между импульсным лазером 6 и матрицей с анализируемым веществом 9 размещена фокусирующая оптика 7, предназначенная для фокусирования лазерного излучения. В качестве импульсного лазера 6 может быть использован, например, импульсный азотный лазер ультрафиолетового диапазона с длиной волны излучения 337 нм, импульсные лазеры инфракрасного диапазона, например, CO₂-лазер, эксимерные или другие газовые лазеры. В этих же целях наряду с указанными средствами реализации можно применять любые импульсные твердотельные лазеры и всевозможные гармоники их излучения, являющиеся результатом преобразования в нелинейных кристаллах. В качестве фокусирующей оптики 7 используют фокусирующую линзу. Излучение лазера 6 с энергией в импульсе порядка нескольких МДж поглощается матрицей с анализируемым веществом 9, в результате чего происходит разрушение решетки и формирование электрической плазмы. Этот процесс сопровождается передачей импульса макромолекулам, которые испаряются и впоследствии заряжаются в зависимости от характеристик плазмы и попадают в виде ионов в масс-анализатор.

Масс-анализатор представляет собой вакуумную камеру 15, два сетчатых электрода 12 и 13, размещенный между ними сепаратор 14 и источник напряжения 10 со средствами синхронизации времени подачи сигналов (Фиг.1а) на электрод 11 и указанные сетчатые электроды. Элементы 12, 13 и 14 размещены в вакуумной камере 15, источник напряжения 10 выполнен за ее пределами. В камере 15 поддерживается вакуум на уровне 10^-8 мБар. Сепаратор 14 представляет собой дрейфовое пространство с отсутствием в нем поля, ограниченное со стороны электродов 12 и 13 металлическими сетками, не препятствующими пролету ионов, а по бокам сплошным металлическим экраном, который заземлен. Для образования первого ускоряющего промежутка первый сетчатый электрод 12 установлен на расстоянии от держателя с анализируемым веществом и ориентирован своей плоскостью параллельно плоскости держателя с анализируемым веществом. Первый сетчатый электрод 12 выполнен в виде двух сеток, расположенных параллельно, с зазором между ними для образования промежутка с отсутствием в нем поля. Для образования второго ускоряющего промежутка сепаратор 14 размещен на расстоянии от первого сетчатого электрода 12. Такое выполнение обеспечивает требуемое качество ионизованного макромолекулярного потока, поступающего в сепаратор 14 в отношении коллимированности и моноэнергетичности. Второй сетчатый электрод 13 установлен с возможностью деления пространства между сепаратором 14 и матрицей микромеханических кантилеверов 3 системы детектирования сепарированных в соответствии с отношением заряд/масса ионов. Источник напряжения 10 соединен с сетчатыми электродами 12 и 13 и электродом 11 держателя с анализируемым веществом. Масс-анализатор связан с системой детектирования посредством потока ионов исследуемых макромолекул, прошедших сепарацию и взаимодействующих с матрицей микромеханических кантилеверов 3 системы детектирования.

Сепаратор 14, первый и второй сетчатые электроды 12 и 13, соответственно, держатель с анализируемым веществом, а также матрица микромеханических кантилеверов 3 системы детектирования размещены на одной оси.

Поток ионизованных макромолекул проходит в вакуумной камере 15 путь от держателя с анализируемым веществом до матрицы микромеханических кантилеверов 3 системы детектирования через сетчатый электрод 12, сепаратор 14 и сетчатый электрод 13. Благодаря электрическому полю в вакуумной камере 15, для создания которого на сетчатые электроды 12 и 13 от источника напряжения 10 подается высоковольтный потенциал, ионы макромолекул, заряженные таким же зарядом, как и на электроде 11, ускоряются в направлении матрицы микромеханических кантилеверов 3 системы детектирования. Разность по времени между запуском лазерного импульса и прибытием сигнала от матрицы микромеханических кантилеверов 3 характеризует массу макромолекулы.

Вышерассмотренные функциональные узлы предлагаемого масс-спектрометра могут быть практически реализованы также, как в приведенном ближайшем техническом решении.

Детектирование ионов исследуемых макромолекул осуществляет система детектирования посредством регистрации отклонения лепестка микромеханического кантилевера в результате воздействия налетающего иона макромолекулы.

Система детектирования сепарированных в соответствии с отношением заряд/масса ионов может быть реализована двумя вариантами. Первый вариант реализации базируется на основе оптической регистрации отклонений кантилевера, второй вариант – на основе емкостной регистрации отклонений кантилевера.

В первом варианте систему детектирования выполняют в составе последовательно оптически связанных источника излучения 1, коллимирующей оптики 2, матрицы микромеханических кантилеверов 3, проектирующей оптики 4, экрана 16 и фотоприемника 5 (Фиг.2). При этом выполнение матрицы микромеханических кантилеверов 3 осуществлено так, как показано на Фиг.3.

Во втором варианте систему детектирования выполняют в виде матрицы микромеханических кантилеверов 3 с системой считывания, при этом микромеханические кантилеверы снабжены элементами считывания в интегральном исполнении с микромеханическими кантилеверами, с принципом действия, основанным на измерении емкости лепестка относительно входа элемента считывания. Система считывания выполнена на основе известного технического решения (R.Amantea, С.М.Knoedler, F.Р.Pantuso, V.К.Patel, D.J.Sauer, and J.R.Tower «An uncooled IR imager with 5 mK NETD», Proceedings of SPIE – the International Society for Optical Engineering, 3061, p.p.210-222, 1997). Данный вариант позволяет исключить оптические элементы в системе детектирования: элементы 1, 2, 4, 5 и 16 (см. Фиг.2). При этом выполнение матрицы микромеханических кантилеверов 3 осуществлено так, как показано на Фиг.4.

В первом варианте реализован теневой метод регистрации отклонений в матрице микромеханических кантилеверов, возникающих при передаче импульса в результате соударения с ионом. При этом в качестве источника излучения 1 для подсветки может быть использован лазер, с излучением от ультрафиолетового до дальнего инфракрасного диапазона, светодиод или лампа накаливания. Коллимирующая оптика 2 выполнена в составе корректирующих и коллимирующих линз или зеркал. Конкретный выбор оптики определяется используемым источником излучения 1. В частности, в качестве коллимирующей оптики может быть использована как коллимирующая линза, так и линзо-зеркальный объектив, обеспечивающие формирование параллельного или слаборасходящегося пучка. Проектирующая оптика 4 представляет собой проектирующий объектив, переносящий изображение матрицы микромеханических кантилеверов 3 в плоскость приемной площадки фотоприемника 5. В качестве последнего может быть использован фотоприемник с внешним или внутренним фотоэффектом, например, такой, как фотоэлемент, или фотоумножитель, или фотосопротивление, или фотодиод. Экран 16, отсекающий основное излучение подсветки (источника излучения 1), представляет собой ножевую диафрагму.

Матрица микромеханических кантилеверов 3 выполнена в составе (Фиг.3) подложки детектора 18, в качестве которой может быть использована подложка, например, из кремния или сапфира, или другого материала, на которой размещают микромеханические кантилеверы 17. Матрица микромеханических кантилеверов 3 может содержать как один микромеханический кантилевер 17, так и быть реализована в многоэлементном исполнении. Реализация матрицы микромеханических кантилеверов 3 в многоэлементном исполнении является предпочтительной, поскольку мелкомасштабная структура покрытия рядами микромеханических кантилеверов обеспечивает пространственное разрешение для определения точки контакта.

Микромеханический кантилевер 17 (Фиг.3) содержит элементы: ножку 21, кронштейн 20, отражающий слой 22, основание лепестка 19. Ножка 21 выполнена на подложке детектора 18 с возможностью расположения микромеханического кантилевера 17 над ее поверхностью. С ножкой 21 связан кронштейн 20, который пространственно расположен над поверхностью подложки детектора 18, например параллельно. Кронштейн 20 соединен с основанием лепестка 19, которое выполнено, например, в виде квадрата. Основание лепестка 19 также расположено над поверхностью подложки детектора 18. На основание лепестка 19 нанесен отражающий слой 22. Основание лепестка 19 и отражающий слой 22 образуют лепесток микромеханического кантилевера. Ножка 21, кронштейн 20 и основание лепестка 19 могут быть изготовлены с использованием, например, SiO₂, Si₃N₄. Отражающий слой 21 выполняют из металла, например Ti, Au.

При реализации второго варианта выполнения системы детектирования матрица микромеханических кантилеверов 3 выполнена в составе (см. Фиг.4) подложки детектора 18, обкладки конденсатора подложки детектора 23 и микромеханических кантилеверов 17, размещенных на подложке детектора 18, которая заземлена. В качестве подложки детектора 18 может быть использована подложка, например, из кремния или сапфира. Обкладка конденсатора 23 представляет собой проводящую пленку, например Ti или Au, в которой выполнены сквозные окна (контактное окно 25). В них размещают микромеханические кантилеверы 17. Матрица микромеханических кантилеверов 3 может содержать как один микромеханический кантилевер 17, так и быть реализована в многоэлементном исполнении. Реализация матрицы микромеханических кантилеверов 3 в многоэлементном исполнении является предпочтительной, поскольку мелкомасштабная структура покрытия рядами микромеханических кантилеверов обеспечивает пространственное разрешение для определения точки контакта.

В случае второго варианта реализации системы детектирования микромеханический кантилевер 17 (Фиг.4) содержит элементы: ножку 21, кронштейн 20, основание лепестка 19, обкладку конденсатора на микромеханическом кантилевере 24. Ножка 21 выполнена на подложке детектора 18 с возможностью расположения микромеханического кантилевера 17 над ее поверхностью. С ножкой 21 связан кронштейн 20, который пространственно расположен над поверхностью подложки детектора 18, например параллельно. Кронштейн 20 соединен с основанием лепестка 19, которое выполнено, например, в виде квадрата. Основание лепестка 19 также расположено над поверхностью подложки детектора 18. Верхняя часть основания лепестка 19, кронштейна 20 и вертикальная часть ножки 21 с одной стороны покрыты сплошным проводящим слоем (обкладка конденсатора на микромеханическом кантилевере 24). Основание лепестка 19 с нанесенным на него проводящим слоем (часть обкладки конденсатора на микромеханическом кантилевере 24) образуют лепесток микромеханического кантилевера. Ножка 21, кронштейн 20 и основание лепестка 19 могут быть изготовлены с использованием, например, SiO₂, Si₃N₄. В качестве материала обкладки конденсатора на микромеханическом кантилевере 24 используют металл, например Ti или Au. Обкладки конденсатора 23, 24 и ножка 21 выполнены с достижением электрической развязки между указанными обкладками.

Основным требованием к микромеханическим кантилеверам 17 (в отношении достижения возможности регистрации отклонения) является чувствительность к воздействиям с энергией около 20 кэВ. Для удовлетворения этому требованию проводится оптимизация выбора значения конструктивных параметров (геометрических размеров) микромеханического кантилевера, например, таких как толщина и высота ножки 21. Конструктивные параметры подбирают такими, чтобы величина резонансной частоты ₀ лежала в интервале 10²÷10⁴ с^-1.

Матрица микромеханических кантилеверов 3 как в первом варианте, так и во втором варианте, изготавливается методами хорошо развитой полупроводниковой планарной технологии, с использованием широкого ряда материалов, применяемых в производстве полупроводниковых приборов, и технологических операций. В частности, использование литографии в сочетании с предварительным осаждением, выращиванием слоев с толщинами типичными для планарной технологии, составляющими десятые доли мкм, являющихся как основными, предназначенными для создания конструктивных элементов, так и вспомогательными, жертвенными, которые в процессе осуществления технологического цикла удаляют, позволяет реализовать вышеописанные микромеханические кантилеверы с требуемыми конструктивными параметрами и матрицы в многоэлементном исполнении. Отличительная особенность данных многоэлементных матриц микромеханических кантилеверов заключается в том, что они выполнены с возможностью определения момента времени взаимодействия и точки контакта ускоренной макромолекулы с поверхностью лепестка микромеханического кантилевера, приводящего к передаче импульса макромолекулы лепестку микромеханического кантилевера и последующему отклонению лепестка на расстояние, определяемое массой и энергией макромолекулы.

Устройство работает следующим образом.

В момент времени t₀ (Фиг.1б) в результате воздействия на матрицу с анализируемым веществом 9 излучения от импульсного лазера 6, прошедшего для фокусировки фокусирующую оптику 7, происходит испарение и ионизация молекул анализируемых веществ. Процесс ионизации растянут во времени и продолжается некоторое время после окончания действия лазерного импульса. Так, длительность последнего порядка 10^-8 с, а процесс образования ионов длится порядка 10^-6 с.

Разные ионы возникают в разные моменты времени и ионные пики в масс-спектре могут уширяться. Для устранения данного явления фотоиспарение проводят при нулевом поле E₁=0.

После того, как процесс образования ионов в основном завершается, напряжение на электроде 11 U₁ в момент времени t₁ меняется ступенчатым образом на величину U (Фиг.1б). Все образованные к этому моменту ионы начинают равноускоренно двигаться в направлении поля E₁ и пролетают первый ускоряющий промежуток, расположенный между матрицей с анализируемым веществом 9 и первым сетчатым электродом 12. Достигая первого сетчатого электрода 12 с потенциалом U₂, состоящего из двух параллельно расположенных с зазором сеток, ионы попадают в промежуток между сетками с отсутствием в нем поля. После пролета этого промежутка они попадают во второй ускоряющий промежуток, расположенный между первым сетчатым электродом 12 и сепаратором 14, и еще раз ускоряются полем Е₂. После вторичного ускорения полем ионы влетают в дрейфовое пространство сепаратора 14, представляющего собой большой промежуток с отсутствием в нем поля. В дрейфовом пространстве ионы разделяются на пакеты с одинаковым значением параметра eZ/M, где е – заряд протона, Z – кратность заряда иона, М – масса иона.

Амплитуды потенциалов U₁ и U₂ задают такими, что процесс сепарирования ионов полностью завершается к моменту достижения ими матрицы микромеханических кантилеверов 3 системы детектирования.

В некоторый момент времени t_x (Фиг.1б) на второй сетчатый электрод 13, делящий промежуток между сепаратором 14 и детектором ионов (матрицей микромеханических кантилеверов 3) на две части, подают прямоугольный импульс напряжения из большой амплитуды, от 20 кВ и более (амплитуды напряжений U₁ и U₂ на порядок меньше). Ионы, которые к этому моменту времени успевают пролететь второй сетчатый электрод 13 и находятся в последнем, перед детектором ионов, промежутке, приобретают дополнительный большой импульс и впоследствии регистрируются детектором. Причем, чем ближе они будут находиться относительно второго сетчатого электрода 13 в момент времени t_x (Фиг.1б), тем выше будет эффективность их регистрации.

Ионы макромолекул, которые к моменту времени t_x (Фиг.1б) не успевают пролететь второй сетчатый электрод 13, отражаются назад и вовсе не достигают детектора ионов.

Ионы макромолекул, которые к моменту времени t_x (Фиг.1б) успевают пролететь второй сетчатый электрод 13 и практически достичь детектора ионов, не регистрируются по причине малости приобретенного ими импульса для эффективного воздействия на микромеханические кантилеверы.

Таким образом, меняя момент подачи высоковольтного импульса t_x и повторяя все вышеописанное, можно просканировать и зарегистрировать весь времяпролетный масс-спектр.

Рассмотрим процесс регистрации отклонений, возникающих при импульсном воздействии сгустка ионов на матрицу микромеханических кантилеверов (3) системы детектирования (Фиг.2) в случае выполнения системы детектирования по первому варианту.

Свет для подсветки от источника излучения 1 с помощью коллимирующей оптики 2 преобразуется в параллельный световой пучок. Коллимированный пучок света под углом, отличным от нормального, освещает всю плоскость матрицы микромеханических кантилеверов 3. Рассеянное матрицей микромеханических кантилеверов 3 излучение подсветки попадает в проектирующую оптику (проектирующий объектив) 4, которая строит изображение матрицы микромеханических кантилеверов 3 в плоскости приемной площадки фотоприемника 5. Размещенный в фокальной плоскости проектирующего объектива экран 16 (ножевая диафрагма) отсекает (закрывает) зеркально отраженное от матрицы микромеханических кантилеверов 3 излучение.

Ионы макромолекул, достигая детектора и взаимодействуя с микромеханическими кантилеверами, вызывают их отклонение и колебание.

При надлежащем расположении, ориентировании, экрана 16 в пространстве, интенсивность излучения, рассеянного под углами, отличными от угла зеркального отражения от плоскости матрицы микромеханических кантилеверов 3, и не попадающего на экран 16, максимальна. Для этого экран 16 должен быть ориентирован параллельно рядам микромеханических кантилеверов и располагаться в пространстве со стороны их крепления к подложке детектора, закрывая центр фокальной плоскости, как схематически показано на Фиг.2.

При взаимодействии ионов макромолекул с матрицей микромеханических кантилеверов 3 имеет место изменение интенсивности излучения, что регистрируется фотоприемником 5.

Рассеянное матрицей микромеханических кантилеверов 3 излучение, в общем случае, содержит зеркально отраженную компоненту, имеющую узкое угловое распределение (его расходимость определяется дифракцией на апертуре матрицы), и фон, имеющий широкое угловое распределение, на котором могут в той или иной степени проявляться дифракционные максимумы более высокого порядка.

Отметим, что если в качестве фотоприемника 5 в данной схеме (Фиг.1) использовать фотоприемную матрицу, то можно регистрировать не только полный сигнал, но и распределение ионов в плоскости матрицы микромеханических кантилеверов 3, а это открывает возможность изучать распределение ионов по скоростям и получать ценную информацию о процессах, предшествующих ионизации (так называемая техника «имиджинга»).

Альтернативный способ считывания информации с микромеханических кантилеверов, позволяющий исключить в системе детектирования использование метода оптической регистрации, который был рассмотрен выше, заключается в измерении емкости лепестка микромеханического кантилевера после его столкновения с макромолекулой относительно входа элемента считывания. При этом элементы считывания реализуются в интегральном исполнении с микромеханическими кантилеверами и преобразуют изменение емкости лепестка микромеханического кантилевера в регистрируемый электрический сигнал (R.Amantea, С.М.Knoedler, F.P.Pantuso, V.К.Patel, D.J.Sauer, and J.R.Tower «An uncooled IR imager with 5 mK NETD», Proceedings of SPIE – the International Society for Optical Engineering, 3061, p.p.210-222, 1997), который снимается с системы детектирования.

Использование в системе детектирования микромеханических кантилеверов, предназначенных для регистрации импульса ускоренной макромолекулы, в отличие от альтернативной, приведенной в известном техническом решении (R.Amantea, С.М.Knoedler, F.P.Pantuso, V.К.Patel, D.J.Sauer, and J.R.Tower «An uncooled IR imager with 5 mK NETD», Proceedings of SPDE – the International Society for Optical Engineering, 3061, p.p.210-222, 1997), возможности использования кантилеверов, предназначенных для регистрации тепловой энергии, применение которых в системе детектирования основано на измерении температуры лепестка микромеханического кантилевера, имеет существенные преимущества. Во втором случае необходимо реализовывать двухслойные ножки, с различными коэффициентами термического расширения, а также обеспечить выполнение жестких требований на теплопритоки от подложки детектора к лепестку. Это, во-первых, порождает технологические проблемы создания таких микромеханических кантилеверов, а, во-вторых, постоянная времени температурной релаксации таких микромеханических кантилеверов, как правило, превышает 10 мс. Предлагаемый вариант использования микромеханических кантилеверов, основанный на детектировании импульса, позволяет избежать данных проблем, поскольку в этом случае отсутствует необходимость изготовления ножки микромеханического кантилевера двухслойной, снимаются требования на теплоизоляцию лепестка микромеханического кантилевера относительно подложки. При этом реально достижимая величина постоянной времени механической релаксации микромеханических кантилеверов в предлагаемом изобретении составляет 1 мс.

Формула изобретения

1. Масс-спектрометр для исследования макромолекул, содержащий держатель с анализируемым веществом, связанное с ним средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор, масс-анализатор и связанную с масс-анализатором систему детектирования, отличающийся тем, что масс-анализатор связан с держателем с анализируемым веществом, система детектирования выполнена на основе матрицы микромеханических кантилеверов с возможностью определения момента времени взаимодействия и точки контакта ускоренной макромолекулы с поверхностью лепестка микромеханического кантилевера, приводящего к передаче импульса макромолекулы лепестку микромеханического кантилевера и последующему отклонению лепестка на расстояние, определяемое массой и энергией макромолекулы.

2. Масс-спектрометр по п.1, отличающийся тем, что для регистрации отклонения лепестка микромеханического кантилевера система детектирования выполнена в составе последовательно оптически связанных источника излучения, коллимирующей оптики, матрицы микромеханических кантилеверов, проектирующей оптики и фотоприемника.

3. Масс-спектрометр по п.1, отличающийся тем, что для регистрации отклонения лепестка микромеханического кантилевера система детектирования выполнена в составе матрицы микромеханических кантилеверов и электрически связанной с ней системы считывания, при этом микромеханические кантилеверы снабжены элементами считывания в интегральном исполнении с микромеханическими кантилеверами с принципом действия, основанным на измерении емкости лепестка относительно входа элемента считывания.

4. Масс-спектрометр по п.1, отличающийся тем, что микромеханический кантилевер выполнен с конструктивными параметрами, определяющими возможность наличия регистрируемого отклонения лепестка.

5. Масс-спектрометр по п.1, отличающийся тем, что матрица микромеханических кантилеверов выполнена многоэлементной.

6. Масс-спектрометр по п.2, отличающийся тем, что матрица микромеханических кантилеверов выполнена многоэлементной.

7. Масс-спектрометр по п.3, отличающийся тем, что матрица микромеханических кантилеверов выполнена многоэлементной.

8. Масс-спектрометр по п.4, отличающийся тем, что матрица микромеханических кантилеверов выполнена многоэлементной.

9. Масс-спектрометр по п.2, отличающийся тем, что матрица микромеханических кантилеверов выполнена в виде подложки детектора, на которой установлены микромеханические кантилеверы, при этом микромеханический кантилевер выполнен в составе ножки, кронштейна, отражающего слоя, основания лепестка; ножка выполнена на подложке детектора с возможностью расположения микромеханического кантилевера над ее поверхностью; с ножкой связан кронштейн, который пространственно расположен над поверхностью подложки детектора; кронштейн соединен с основанием лепестка, которое также расположено над поверхностью подложки детектора; на основание лепестка нанесен отражающий слой, образующий с основанием лепестка в совокупности лепесток.

10. Масс-спектрометр по п.3, отличающийся тем, что матрица микромеханических кантилеверов выполнена в виде подложки детектора, обкладки конденсатора подложки детектора и микромеханических кантилеверов, размещенных на подложке детектора, при этом микромеханический кантилевер выполнен в составе ножки, кронштейна, основания лепестка, обкладки конденсатора на микромеханическом кантилевере; ножка выполнена на подложке детектора с возможностью расположения микромеханического кантилевера над ее поверхностью; с ножкой связан кронштейн, который пространственно расположен над поверхностью подложки детектора; кронштейн соединен с основанием лепестка, которое также расположено над поверхностью подложки детектора;

верхние части основания лепестка и кронштейна, а также вертикальная часть ножки с одной стороны покрыты сплошным проводящим слоем, представляющим собой обкладку конденсатора на микромеханическом кантилевере, при этом лепесток образован основанием лепестка с нанесенным на него проводящим слоем; обкладки конденсатора подложки детектора и микромеханического кантилевера, ножка выполнены с достижением электрической развязки между указанными обкладками; подложка детектора заземлена.

11. Масс-спектрометр по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что держатель с анализируемым веществом выполнен в виде подложки, на поверхности которой размещена матрица с анализируемым веществом, а на противоположной стороне выполнен электрод для подачи напряжения, и через который электрически осуществлена связь с масс-анализатором, а другая связь с масс-анализатором реализована посредством потока ионов исследуемых макромолекул, держатель с анализируемым веществом размещен в вакуумной камере масс-анализатора.

12. Масс-спектрометр по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что средство для ионизации и введения макромолекул в масс-анализатор выполнено в виде импульсного лазера и фокусирующей оптики, оптически последовательно связанных с держателем с анализируемым веществом с возможностью подачи излучения на анализируемое вещество, извлечения его из матрицы в виде ионов или фрагментов ионов.

13. Масс-спектрометр по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что масс-анализатор выполнен в виде вакуумной камеры, размещенных в ней двух сетчатых электродов, между которыми размещен сепаратор, представляющий собой дрейфовое пространство с отсутствием в нем поля, ограниченное со стороны электродов металлическими сетками, не препятствующими пролету ионов, а по бокам сплошным металлическим экраном, при этом первый сетчатый электрод для образования первого ускоряющего промежутка установлен на расстоянии от держателя с анализируемым веществом, первый сетчатый электрод выполнен в виде двух сеток, расположенных параллельно, с зазором между ними для образования промежутка с отсутствием в нем поля, для образования второго ускоряющего промежутка сепаратор размещен на расстоянии от первого сетчатого электрода, второй сетчатый электрод установлен с возможностью деления пространства между сепаратором и матрицей микромеханических кантилеверов системы детектирования сепарированных ионов в соответствии с отношением заряд/масса, для подачи напряжения на сетчатые электроды и держатель с анализируемым веществом выполнен источник напряжения со средствами синхронизации времени подачи сигналов; масс-анализатор связан с системой детектирования посредством потока ионов макромолекул, сепарированных в соответствии с отношением заряд/масса.

РИСУНКИ