Патент на изобретение №2332465
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЦИСТНОГО ЭХИНОКОККОЗА В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в эпидемиологии. Предложен способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза, который заключается в выделении ДНК из клеток ларвоцисты эхинококка и проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймеров, специфичных в отношении митохондриального гена CO1 Echinococcus granulosus. Для использования в качестве прямого и обратного праймеров предложены соответственно олигонуклеотиды с последовательностями 5′ TGTGTTGATTTTGCCTGG 3′ и 5′ GCCACCACAAACCAAGTATC 3′, которые являются более универсальными в отношении различных изолятов возбудителя, что повышает надежность анализа при обследовании населения в различных регионах.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии, и может быть использовано при идентификации генотипа возбудителя цистного эхинококкоза у населения. Для осуществления молекулярно-генетических методов необходимо получение фрагментов ДНК маркерных генов в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Гены митохондриальной ДНК являются наиболее удобными маркерами для изучения популяционного генетического полиморфизма и широко используются для геномного типирования различных видов животных. Они исключительно редко подвергается рекомбинациям, а возникающие несложные мутации являются таксоноспецифичными. Прототипом изобретения является способ получения фрагментов митохондриального гена СO1 Echinococcus granulosus в полимеразной цепной реакции синтеза ДНК при помощи праймеров: Данный метод находит широкое применение при получении фрагментов ДНК, необходимых для выявления генотипа Echinococcus spp., методами секвенирования, PCR-RFLP, RAPD. Однако при проведении исследований по идентификации изолятов Е. granulosus из Южного Урала способом Bowles J. et al. (1992) часть образцов ДНК не амплифицировались. Техническим результатом изобретения является повышение точности и надежности получения фрагментов ДНК митохондриального гена CO1 Е. granulosus методом ПЦР за счет создания и использования более универсальных в отношении различных изолятов праймеров. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. 2, 0,001% желатина, по 3 мкл 2,5 мМ каждого из dNTP, 2 ед Tag-полимеразы, 0,25 пкМ каждого праймера и 25 нг геномной ДНК. Сверху наслаивают 20 мкл легкого минерального масла. В работе используют подобранные нами праймеры для СО1 следующей структуры: “форвард” 5′ TGTGTTGATTTTGCCTGG 3′; “реверс” 5′ GCCACCACAAACCAAGTATC 3′. Отжиг осуществляют при температуре 52°С, амплификацию проводят при следующем режиме термоциклера: 94°С – 3 мин 1 цикл
72°C – 1 мин 1 цикл 16°С – хранение. Получают фрагменты ДНК, необходимые для проведения идентификации генотипа Echinococcus granulosus методами секвенирования, PCR-RFLP, RAPD. Метод доступен по реактивам и оборудованию. Пример 1. Больной К., 14 лет, из Давлекановского района Республики Башкортостан, поступил в хирургическое отделение с диагнозом эхинококковая киста правого легкого. После госпитализации и обследования проведена эхинококкэктомия. Кусочек герминативной оболочки кисты взят на молекулярно-генетический анализ. Выделена ДНК. В полимеразной цепной реакции, проведенной методом Bowles J. et al. (1992), амплификаты не получены. Проведено исследование предлагаемым способом. Для этого получены образцы ДНК из клеток герминативной оболочки материнской кисты Е. granulosus фенол-хлороформным методом. Реакцию амплификации проводили в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 0,001% желатина, по 3 мкл 2,5 мМ каждого из dNTP, 2 ед Tag-полимеразы, 0,25 пкМ каждого праймера и 25 нг геномной ДНК. Сверху наслаивали 20 мкл легкого минерального масла. В работе использовали подобранные нами праймеры для СO1 следующей структуры: “форвард” 5′ TGTGTTGATTTTGCCTGG 3′; “реверс” 5′ GCCACCACAAACCAAGTATC 3′. Отжиг осуществляли при температуре 52°С, амплификацию проводили при следующем режиме термоциклера: 94°С – 3 мин 1 цикл
72°С – 1 мин 1 цикл 16°С – хранение, что позволило получить фрагменты гена CO1 Е. granulosus. Проведение последующей идентификации генотипа стало возможным. Пример 2. Больная Б., 5 лет, из Баймакского района Республики Башкортостан, поступила в хирургическое отделение с сочетанным эхинококкозом правого и левого легкого. После операции кусочек герминативной оболочки одной кисты взят на молекулярно-генетический анализ. Выделена ДНК. Проведена ПЦР методом Bowles J. et al. (1992) – амплификаты не получены. Использование предлагаемого способа позволило получить фрагменты ДНК гена CO1 Е. granulosus и провести идентификацию генотипа возбудителя эхинококкоза.
Формула изобретения
Способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза в биологическом образце, включающий выделение ДНК и ее анализ на наличие последовательности митохондриального гена С01 Echinococcus granulosus путем проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что используют праймеры следующей структуры: 5TGTGTTGATTTTGCCTGG 3′ и 5’GCCACCACAAACCAAGTATC 3′.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 19.12.2008
Извещение опубликовано: 10.08.2010 БИ: 22/2010
|
||||||||||||||||||||||||||
