Патент на изобретение №2332449

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГАЛОФИЛЬНЫХ И ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ГЕТЕРОТРОФНЫХ ЖГУТИКОНОСЦЕВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает подготовку питательной среды, содержащей NaCl, MgSO₄×7H₂O, KCl, CaCl₂×2Н₂O, KNO₃, К₂НРО₄×3Н₂О, автолизат дрожжей и дистиллированную воду. Внесение в питательную среду исследуемой пробы бентоса или воды. Выделение чистой культуры жгутиконосцев с последующим культивированием на питательной среде того же состава и периодическим пересевом чистой культуры. Изобретение позволяет повысить эффективность выделения и культивирования галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев и сократить трудоемкость процесса. 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”- М., 1994. FROLOV A.O., KARPOV S.A. and MYLNIKOV A.P., The ultrastructure of procryptobia sorokini (Zhukov) comb. nov. and rootlet homology in kinetoplastids. Protistology 2(2), 85-95 (2001).

Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией, и может быть использовано при проведении цитологических, физиолого-биохимических и генетических исследований.

Предварительное наращивание биомассы галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев является необходимым этапом в изучении их видового состава в природных водоемах и для получения культуры, так как некоторые виды галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, присутствующие в незначительном количестве в пробе, могут быть не учтены при микроскопическом исследовании.

Разработаны и активно используются способы выделения пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев. Они основаны на добавлении в пробы воды синтетических сред (Пратта, Лозина-Лозинского и др.), создающих благоприятные условия для размножения гетеротрофных жгутиконосцев с дополнительным внесением бактерий определенных видов в качестве «подкормки» [Жуков Б.Ф. Атлас пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев (биология, экология, систематика). – Рыбинск, 1993. – 160 с.].

Однако применение этих способов для изучения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев соленых водоемов ограничивается определенными трудностями: гибель негалотолерантных бактерий в условиях повышенной солености делает «подкормку» неэффективной; добавление синтетических сред приводит к значительному опреснению исходной пробы воды, что создает неблагоприятные условия для галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, приспособленных к повышенной минерализации; скорость наращивания биомассы галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в таких условиях очень низкая, что делает исследование довольно длительным.

Известный способ имеет ряд существенных недостатков, связанных с трудоемким многоэтапным методом предварительной подготовки: отбор воды, фильтрация через мембранный фильтр, автоклавирование. При большом количестве исследуемых водоемов с различной степенью минерализации этот способ значительно увеличивает количество применяемых вариантов сред и пролонгирует исследование. Другим значительным недостатком является непостоянство химического состава природной воды, который изменяется в зависимости от сезона года. Кроме того, этот способ не рассчитан на выделение гетеротрофных жгутиконосцев из местообитаний с экстремальной соленостью. Скорость размножения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в воде высокоминерализованных водоемов довольно низка, что затрудняет получение большого выхода их биомассы.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ выделения и культивирования морских слабогалофильных жгутиконосцев с использованием среды Шмальца-Пратта: NaCl – 28,15 г; KCl – 0,67 г; MgCl₂×6H₂O – 5,51 г; MgSO₄×7H₂O – 6,92 г; CaCl₂×6Н₂O – 1,45 г; KNO₃ – 0,025 г; К₂HPO₄ – 0,013 г, дистиллированной воды до 1000 мл. Минерализация среды равна 36

Недостатком прототипа, на взгляд авторов, является то, что минерализация среды Шмальца-Пратта равна 36, что в 2-10 раз ниже, чем минерализация многих континентальных водоемов с повышенным содержанием солей. Поэтому на среде Шмальца-Пратта развиваются только слабогалофильные и галотолерантные виды гетеротрофных жгутиконосцев, адаптированные к морской среде (Cafeteria roenbergensis, Cafeteria marsupialis, Monosiga ovata, Pendulomonas adriperis, Bodo designis и др.), которые зачастую не являются доминирующими в галофильном биоценозе. В то же время представители галофильных видов (Pleurostomum salinum, Pleurostomum turgidum, Palustrimonas yorkeensis и др.) погибают на среде Шмальца-Пратта в связи с их неприспособленностью к низкой минерализации. Это объясняется узким диапазоном их галотолерантности, не соответствующим минерализации среды Шмальца-Пратта.

Также недостатком данного способа является то, что для длительного культивирования галофильных и гетеротрофных жгутиконосцев их необходимо регулярно подкармливать, так как бактерии быстро «выедаются» галофильными и галотолерантными гетеротрофными жгутиконосцами. А обычно используемые для подкормки бактерии не являются характерными для микрофлоры соленых водоемов и поэтому практически не размножаются. А многие галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы, в свою очередь, не приспособлены употреблять их в пищу.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в сокращении трудоемкости и повышении эффективности выделения из планктонных и бентосных проб минерализованных водоемов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, что выражается в увеличении количества обнаруживаемых видов в пробе и в возрастании скорости их размножения.

Для достижения названного технического результата в заявляемом способе осуществляют подготовку питательной среды, содержащей NaCl, MgSO₄×7H₂O, KCl, CaCl₂×2Н₂O, KNO₃, К₂НРО₄×3Н₂O, автолизат дрожжей и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:

Дистиллированная вода до 1,0 л, внесение в нее исследуемой пробы бентоса или воды, инкубацию проб, выделение чистой культуры жгутиконосцев с последующим, в случае необходимости, культивированием на среде того же состава и периодическим пересевом чистой культуры.

В предлагаемом способе в качестве основы питательной среды используются осмотически активные соли: хлорид натрия, сульфат магния, хлорид калия и хлорид кальция, входящие в состав наиболее широко используемых сред для галофильных микроорганизмов [Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы его практического использования. – Киев: Наукова думка, 1973. – 244 с]. В результате минерализация среды, составляющая 68, является оптимальной для большинства умеренно галофильных видов микроорганизмов, обитающих при 3-15% содержания солей, и галотолерантных видов, устойчивых к широкому диапазону солености. Используются простые доступные соли MgSO₄×7H₂O, KNO₃, К₂НРО₄×3Н₂O, которые обычно входят в состав минеральных сред и являются источником биогенных элементов.

Автолизат дрожжей вносится при приготовлении среды в количестве 1,5 г на 1 л жидкой среды. Автолизат дрожжей является основным питательным субстратом, содержит азотистые вещества и ряд ферментов, обеспечивает интенсивный рост бактерий [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О.Биргера. – М.: Медицина, 1982. – 464 с.].

Авторами экспериментально установлено, что добавление в минеральную среду автолизата дрожжей способствует активному размножению бактерий, которые изначально присутствовали в природной воде. Численность бактерий в среде через сутки достигает 10⁸-10⁹ КОЕ/мл. Галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы при обилии пищи размножаются с высокой скоростью, и исключается необходимость в дополнительной подкормке аллохтонными бактериями.

Соли и автолизат дрожжей смешивают и растворяют в дистиллированной воде. Затем питательную среду стерилизуют путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).

За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

Периодически проводят выделение чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев методом получения клонов с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений. В последующем выделенные чистые культуры культивируются в лабораторных условиях и могут использоваться для наращивания биомассы, изучения физиологических свойств и ультраструктуры, экспериментальных исследований, определения систематического положения и т.д.

Для роста чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев полученные с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений отдельные клетки помещают в чашки Петри с жидкой питательной средой того же состава. Инкубацию проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду. В дальнейшем для каждой культуры галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев подбирается оптимальный режим пересева 1-2 раза в месяц. Пересев осуществляется путем внесения образца выросшей культуры галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев объемом 1 мл в свежую жидкую питательную среду того же состава объемом 15 мл.

При пересевах культуры галофильных и галотолерантных жгутиконосцев не очищаются от сопровождающих их автохтонных галофильных бактерий, которые интенсивно размножаются в свежей культуральной среде. Это приводит к тому, что культивируемые галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы, питающиеся сопутствующими бактериями, в короткие сроки (2-3 суток) достигают максимальной численности (10⁵-10⁶ клеток/мл). Отсутствие дополнительной подкормки бактериями является одним из преимуществ предлагаемого способа.

Для осуществления способа используются минеральные соли марки «хч» отечественного или импортного производства и автолизат пекарных дрожжей производства ГНЦ прикладной микробиологии МЗ РФ (Отделение «Питательные среды», г.Оболенск).

Авторами были проведены исследования, позволившие оценить эффективность предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом. В озере Тузлучное (Оренбургская область) с минерализацией воды 100 выделяли галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев для определения их биологического разнообразия. Неконцентрированные и концентрированные пробы воды объемом по 5 мл были посеяны на питательные среды, приготовленные согласно предлагаемому способу и способу-прототипу. Концентрирование проб воды осуществляли путем фильтрования их через мембранный фильтр.

В результате использования предлагаемого способа на второй день инкубации в неконцентрированной пробе воды из озера было обнаружено 6 видов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев (табл.). На пятый день они достигли большой численности и были использованы для получения чистых культур с применением микроманипулятора с микропипеткой. Достоверные результаты получены на второй день инкубации даже без предварительного концентрирования пробы воды.

Согласно способу-прототипу выделение галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев осуществляли также в двух вариантах – без предварительного концентрирования пробы воды и с ее концентрированием.

В неконцентрированной пробе воды на второй день наблюдения обнаружены только единичные клетки Percolomonas cosmopolitus, а на пятые сутки появились еще 2 вида галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев.

В концентрированной пробе воды на второй день наблюдения обнаружены 3 вида галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, а на пятый день – 6 видов.

В отличие от предлагаемого способа способ-прототип позволил выявить 6 видов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев на пятый день наблюдения, причем только в концентрированной пробе. Галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы достигали большей численности в среде заявляемого состава по сравнению со средой Шмальца-Пратта (способ-прототип).

Из исследуемых проб с помощью микроманипулятора был выделен в чистой культуре один вид галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев – Percolomonas cosmopolites. Выделенные отдельные клетки Percolomonas cosmopolites поместили в чашку Петри со свежей жидкой питательной средой заявляемого состава объемом 15 мл. Инкубацию проводили в термостате при температуре 25°С, за развитием наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней с момента внесения пробы в среду.

Рост Percolomonas cosmopolites после инокуляции в среду отмечался на 3 сутки, максимальной численности достигал на 6 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. При использовании среды заявляемого состава Percolomonas cosmopolites сохранял свою жизнеспособность в течение 1 месяца. Для поддержания культуры Percolomonas cosmopolites в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в 14 дней. С использованием этого режима пересева культура успешно сохраняется в лаборатории в течение 24 месяцев.

При использовании для культивирования выделенной культуры Percolomonas cosmopolites среды Шмальца-Пратта (согласно способу-прототипу) их рост начинался на 5 сутки, к 8 суткам численность достигала максимального значения, которое было значительно меньше, чем при использовании для культивирования среды заявляемого состава. После 8 суток наблюдалось резкое падение численности галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев. Percolomonas cosmopolitus сохранялся в активном состоянии на среде Шмальца-Пратта менее двух недель.

Таким образом, заявляемый способ выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев позволяет сократить сроки выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией, повысить эффективность оценки их биоразнообразия, сократить трудоемкость и сроки культивирования галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев.

Способ осуществляется следующим образом.

1) Готовят жидкую питательную среду следующего состава, г/л:

Минерализация среды 68.

Соли и автолизат дрожжей смешивают и растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).

2) Затем в приготовленную жидкую питательную среду, разлитую объемом 10 мл в стерильные чашки Петри диаметром 9,5 см, вносят образцы исследуемой природной воды объемом 5 мл или бентоса (грунт, ил) объемом 0,5 мл.

3) Инкубацию засеянных проб проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

4) Периодически проводят выделение чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев методом получения клонов с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений. Полученные отдельные клетки галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев помещают в чашку Петри диаметром 9,5 см со свежей жидкой питательной средой того же состава объемом 15 мл.

5) Инкубацию проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

6) В случае необходимости дальнейшего поддержания полученных чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в лабораторных условиях используют приготовленную жидкую питательную среду вышеуказанного состава. Периодически (1-2 раза в месяц) производят пересев жгутиконосцев путем добавления 1 мл старой культуры в чашку Петри со свежей питательной средой объемом 15 мл.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

В гипергалинном озере Развал (Оренбургская область) с минерализацией воды 300 необходимо оценить видовой состав галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев и получить их в чистой культуре. С этой целью отобраны пробы природной рапы 30 сентября 2004 г.

Для выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из образца воды использовали жидкую питательную среду. Для ее приготовления были отвешены минеральные соли: NaCl – 60 г; MgSO₄×7H₂O – 10 г; KCl – 1,5 г; CaCl₂×2Н₂O – 2,0 г; KNO₃ – 0,2 г; К₂НРО₄×3Н₂0 – 0,002 г. Соли смешивали и растворяли в дистиллированной воде, доводя конечный объем до 1 л. Таким образом, общая минерализация среды составила 68. Затем в среду добавляли автолизат пекарских дрожжей в количестве 1,5 г/л. После тщательного перемешивания и растворения всех компонентов среду разливали в стерильные флаконы и стерилизовали путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).

Проба рапы объемом 5 мл была внесена в чашку Петри с приготовленной средой объемом 10 мл. Инкубацию проб проводили в термостате при температуре 25°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

Через 2 суток инкубации в среде отмечено массовое развитие Macropharyngomonas halophila.

С помощью микроманипулятора Macropharyngomonas halophila был выделен в чистой культуре. Полученную культуру помещали в чашку Петри со свежей жидкой питательной средой того же состава объемом 15 мл и инкубировали при температуре 25°С. Рост Macropharyngomonas halophila после инокуляции в среду отмечался на 3 сутки, максимальной численности достигал на 7 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. При использовании среды заявляемого состава Macropharyngomonas halophila сохранял свою жизнеспособность в течение более 2 месяцев. Для поддержания культуры Macropharyngomonas halophila в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в месяц путем добавления 1 мл культуры в чашку Петри со свежей питательной средой объемом 15 мл. С использованием этого режима пересева культура успешно сохраняется в лаборатории в течение 24 месяцев.

Пример 2

Из озера Дунино (Оренбургская область) с минерализацией воды 150 были отобраны образцы грунта для определения видового состава галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев. Комочки грунта объемом 5 мл вносили в жидкую питательную среду, приготовленную аналогично примеру 1, и инкубировали в термостате при температуре 28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента посева.

Через три дня появились единичные клетки Rhynchomonas nasuta, Percolomonas cosmopolitus, а через неделю инкубации в среде отмечено их массовое развитие.

Для изучения биологических свойств Rhynchomonas nasuta он был выделен в чистой культуре и в дальнейшем культивировался аналогично примеру 1.

Пример 3.

Из грязе-рапного озера Тузлучное (Оренбургская область) с минерализацией воды 100 для определения биологического разнообразия галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев были взяты пробы ила. Образцы ила объемом 5 мл вносили в жидкую питательную среду, приготовленную аналогично примеру 1, и инкубировали в термостате при температуре 26°С, а затем пробы наблюдали в динамике, что позволило к 6-м суткам выявить 5 видов: Caecitellus parvulus, Cafeteria roenbergensis, Monosiga ovata, Bodo sp., Percolomonas cosmopolitus. К 10 суткам численность галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев достигла максимальных значений.

Для дальнейших исследований с помощью микроманипулятора была выделена чистая культура Monosiga ovata, которая развилась в среде в массовом количестве. Monosiga ovata культивировали на жидкой питательной среде заявляемого состава. Рост Monosiga ovata после инокуляции в среду отмечался на 5 сутки, максимальной численности культура достигала на 10 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. Для поддержания культуры в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в месяц.

Формула изобретения

Способ выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, предусматривающий подготовку питательной среды, содержащей NaCl, MgSO₄·7H₂O, KCl, CaCl₂·2Н₂O, KNO₃, К₂HPO₄·3Н₂O, автолизат дрожжей и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л:

внесение в нее исследуемой пробы бентоса или воды, инкубацию проб, выделение чистой культуры жгутиконосцев с последующим, в случае необходимости, культивированием на среде того же состава и периодическим пересевом чистой культуры.