Патент на изобретение №2332248

(54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ БУСЕРЕЛИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области хроматографии. Бусерелин-сырец обрабатывают 0,1 М раствором уксусной кислоты, осадок отделяют, а жидкую фазу наносят на колонну со стиролдивинилбензольным сорбентом с последующим элюированием раствором уксусной кислоты. Элюат хроматографируют в режиме ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте в градиенте изопропилового спирта с добавками органических кислот. Фракции, содержащие бусерелин сорбционно концентрируют, упаривают и лиофильно высушивают. Способ позволяет получить чистый продукт с высоким выходом при высокой производительности процесса. 5 з. п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к способам хроматографической очистки синтетических пептидных препаратов и может быть использовано для получения высокоочищенных субстанций.

Бусерелин, применяющийся как противоопухолевое средство, является синтетическим аналогом природного гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ).

Он представляет собой пептид, состоящий из 9 аминокислот: 5-оксо-L-пролил-L-гистидил-L-триптофил-L-серил-L-тиролил-О-трет-бутил-D-серил-L-лейцил-L-аргенил-L-пролил-N-этиламид ацетат. Молекулярная масса: 1299,5.

Бусерелин обычно синтезируют классическим методом последовательного наращивания пептидной цепи в растворе, начиная с С-конца.

Известен способ твердофазного синтеза пептидов, в том числе бусерелина, в котором полученный пептид подвергают очистке. Неочищенный пептид растворяют в уксусной кислоте и подвергают хроматографической очистке. Указано, что пептид может быть очищен с использованием одного или нескольких видов хроматографий, таких как: ионообменная хроматография на слабоосновной смоле в ацетатной форме; гидрофобная абсорбционная хроматография на полистиролдивинилбензольном (например, Amberlite® XAD) сорбенте; адсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; гель-хроматография (например, на Sephadex G-25) или противоточное распределение; высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), в частности на обращенно-фазовых ВЭЖХ колонках с октил- или октадецилсилил-кремнеземом (RU 2043362, 10.09.1995).

Известен способ, согласно которому бусерелин, полученный на фирме Welding, очищают методом обращенно-фазной ВЭЖХ на колонне Spherisorb ODS II (250×4 мм, размер частиц 3 мкм), в качестве элюента используют смесь 50% ацетонитрил/0,15% трифторуксусная кислота, скорость элюирования составляет 0,5 мл/мин (RU 2280031, 20.07.2006).

Известен также способ, в котором бусерелин растворяют в пиридин-ацетатном буфере, наносят на колонну с SP-сефадексом, элюируют в градиенте 0,05-1 М пиридин-ацетатного буфера. Выделенные фракции упаривают, растворяют в 2%-ной уксусной кислоте и лиофильно высушивают (RU 2086561, 10.08.1997).

Следует отметить, что известные способы получения бусерелина характеризуются относительно низким содержанием целевого вещества (14-50%), большим количеством родственных примесей и присутствием в продукте синтеза сильно сорбирующихся смолообразных компонентов.

Эти обстоятельства препятствуют эффективной очистке сырья, содержащего бусерелин, путем его прямого нанесения на ВЭЖХ колону и определяют необходимость проведения многостадийной очистки.

Наиболее близким к предложенному способу является способ, описанный в RU 2043362, 1995, который предусматривает обработку сырья уксусной кислотой и двухстадийную хроматографическую очистку. Недостатком известного способа является недостаточная производительность и степень очистки пептида, а также использование элюентов сложного состава, включающих строго контролируемые в субстанциях растворители, такие как ацетонитрил, хлористый метилен и метанол, что усложняет и удорожает процесс.

Задачей настоящего изобретения является повышение степени очистки бусерелина, увеличение производительности и упрощение (удешевление) процесса.

Поставленная задача решается описываемым способом хроматографической очистки бусерелина, включающим обработку бусерелина-сырца раствором уксусной кислоты и последующую двухстадийную хроматографическую очистку полученного раствора, в которой на первой стадии хроматографии раствор бусерелина пропускают через стиролдивинилбензольный сорбент с последующим элюированием раствором изопропилового спирта в уксусной кислоте, а на второй стадии полученный раствор элюата подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазном сорбенте в градиенте изопропилового спирта с добавкой органической кислоты.

Предпочтительно, элюирование бусерелина со стиролдивинилбензольного сорбента осуществляют 10-12%-ным раствором изопропилового спирта в 0,1 М уксусной кислоте.

Предпочтительно, ВЭЖХ осуществляют при содержании изопропилового спирта в элюенте от 4,0 до 6,6% с добавкой в качестве органической лимонной или трифторуксусной кислоты.

Предпочтительно, ВЭЖХ проводят при линейной скорости элюента 1,9-2,5 см/мин и нагрузке по сырью 140-160 грамм на 1 кг сорбента.

Предпочтительно, для обработки бусерелина-сырца используют 0,1 М раствор уксусной кислоты.

Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием бусерелина более 97% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием бусерелина от 30 до 97% подвергают концентрированию на сульфокатионите, элюированию и повторной очистке методом ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте, упариванию и лиофильному высушиванию.

Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1

1,5 кг бусерелина-сырца (чистота 14,8% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза бусерелина, содержащего 200 г целевого пептида и 10% тетрагидрофурана, перемешивают в 15 литрах 0,1 М раствора уксусной кислоты в течение 8 часов и оставляют на 8 часов для отстаивания. Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 0,5 литрами 0,1 М раствора уксусной кислоты. Фильтрат (15 литров) пропускают через стеклянную колонку 140×200 мм, заполненную стиролдивинилбензольным сорбентом с размером частиц 100-250 мкм, размером пор 10-15 нм и удельной поверхностью 750-900 м²/г, предварительно уравновешенную 0,1 М раствором уксусной кислоты. Первые от начала пропускания пробы 4 литра элюата отбрасывают, остальные 11 литров собирают. Колонну дополнительно промывают 5 литрами 10%-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 0,1 М уксусной кислоты, и объединяют с ранее полученными 11 литрами элюата. Получают 16 литров элюата предварительно очищенного сырья с содержанием бусерелина 11,8 мг/мл. Выход бусерелина на стадии предварительной хроматографической очистки составляет 95%.

Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 литра (со скоростью 150 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Диасфер-110-С18 с размером частиц 16 мкм и уравновешенную 4%-ным раствором изопропилового спирта, содержащим 0,1% лимонной кислоты (буфер А). Колонну промывают 35 литрами буфера А и элюируют компоненты линейным градиентом изопропилового спирта от 4 до 6,6% за 3,9 часа, добавляя буфер В (30%-ный раствор изопропилового спирта, содержащий 0,2% трифторуксусной кислоты) до содержания его в элюенте 10%. Этим элюентом с содержанием изопропилового спирта 6,6% продолжают элюирование в течение 3,3 часа, затем проводят регенерацию сорбента, повышая в течение 1,5 часа содержание изопропилового спирта до 40%. Скорость элюирования составляет 150 мл/мин (линейная скорость 1,9 см/мин). Фракции собирают по поглощению при 254 нм объемами 4-5 литров. Чистоту фракций контролируют аналитической ВЭЖХ.

Фракции с содержанием бусерелина более 97% объединяют, разбавляют водой в 1,5 раза, концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируют 30%-ным раствором изопропилового спирта, упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Получают 142,5 г лиофильно высушенного продукта.

Фракции с содержанием бусерелина от 30 до 97% объединяют, концентрируют на колонке с сульфокатионитом, элюируют и рехроматографируют методом ВЭЖХ. Получают 20 г лиофильно высушенного продукта.

Всего получают 162,5 г бусерелина.

Чистота продукта, по данным ВЭЖХ 97,7%.

Выход – 81% от содержания бусерелина в сырье.

Пример 2

1,6 кг бусерелина-сырца (содержание 20,8% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза бусерелина, содержащего 300 г целевого пептида и 10% тетрагидрофурана, перемешивают в 16 литрах 0,1 М раствора уксусной кислоты в течение 24 часов и оставляют на 24 часа для отстаивания. Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 1 литром 0,1 М раствора уксусной кислоты. Фильтрат (17 литров) пропускают через стеклянную колонку 140×200 мм, заполненную стиролдивинилбензольным сорбентом, предварительно уравновешенную 0,1 М раствором уксусной кислоты и затем промывают колонну 5 литрами 12%-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 0,1 М уксусной кислоты. Первые от начала пропускания пробы 4 литра элюата отбрасывают. Остаток собирают и получают 18 литров раствора предварительно очищенного сырья с содержанием бусерелина 16,3 мг/мл. Выход бусерелина после первой стадии хроматографии 98%.

Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 литра (со скоростью 200 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Кромасил-100-С18 с размером частиц 16 мкм и уравновешенную 4%-ным раствором изопропилового спирта, содержащим 0,1% лимонной кислоты (буфер А). Колонну промывают 35 литрами буфера А и элюируют компоненты линейным градиентом изопропилового спирта от 4 до 6,6% за 2,9 часа, добавляя буфер В (30%-ный раствор изопропилового спирта, содержащий 0,2% трифторуксусной кислоты) до содержания его в элюенте 10%. Этим элюентом с содержанием изопропилового спирта 6,6% продолжают элюирование в течение 2,5 часа, затем проводят регенерацию сорбента, повышая в течение 1,1 часа содержание изопропилового спирта до 40%. Скорость элюирования составляет 200 мл/мин (линейная скорость 2,5 см/мин). Фракции собирают по поглощению при 254 нм объемами 4-5 литров. Чистоту фракций контролируют аналитической ВЭЖХ.

Фракции с содержанием бусерелина более 97% объединяют, разбавляют водой в 1,5 раза, концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируют 30%-ным раствором изопропилового спирта, упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают.Получают 235 г лиофильно высушенного продукта.

Фракции с содержанием бусерелина от 30 до 97% объединяют, концентрируют на колонке с сульфокатионитом, элюируют и рехроматографируют методом ВЭЖХ. Получают 31 г лиофильно высушенного продукта.

Всего получают 266 г бусерелина. Чистота продукта, по данным ВЭЖХ – 97,9%.

Выход – 88% от содержания бусерелина в сырье.

Пример 3.

На фиг.1-3 представлены типичные хроматограммы сырья, процесса ВЭЖХ очистки бусерелина и очищенного продукта.

Фиг.1. Хроматограмма бусерелина-сырца.

Колонка 4×250 мм с сорбентом Диасфер-110-С16, 5 мкм.

Элюент: 0,1 М NaCl, содержащий 0,2% ТФУ и 20% ацетонитрила,

Поток: 0,7 мл/мин, детектирование – УФ 280.

Фиг.2. Хроматограмма очистки бусерелина-сырца на колонне 100×330 мм с сорбентом Диасфер-110-С18, 16 мкм.

Проба – 160 г пептидной смеси в 2,7 литрах раствора.

Буфер А – 4%-ный раствор i-PrOH и 0,1% лимонной кислоты;

Буфер В – 30%-ный раствор i-PrOH и 0,2% трифторуксусной кислоты.

Градиент: Буфер А (100%) от 0 до 260 мин, далее линейный градиент до 10% буфера В за 250 мин, далее изократическое элюирование при 10% буфера В (6,6% изопропилового спирта) до 700 мин. Далее регенерация колонки.

Поток: 150 мл/мин, УФ детектирование 254 нм.

Целевую фракцию с чистотой более 97% собирают от 530 до 700 мин.

Фиг.3. Хроматограмма высокоочищенного бусерелина.

Колонка 4×250 мм с сорбентом Диасфер-110-С16, 5 мкм.

Элюент: 0,1 М NaCl, содержащий 0,2% ТФУ и 20% ацетонитрила.

Поток 0,7 мл/мин, детектирование – УФ 280.

Чистота бусерелина – 97,72%.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод очистки в режиме ВЭЖХ реализуется при высоких нагрузках 140-160 грамм пептидной смеси на кг сорбента при линейных скоростях 1,9-2,5 см/мин, обеспечивая высокую чистоту целевого пептида (более 97,5%) при высоком выходе (более 80%).

Формула изобретения

1. Способ хроматографической очистки бусерелина, включающий обработку бусерелина-сырца раствором уксусной кислоты и последующую двухстадийную хроматографию жидкой фазы, отличающийся тем, что на первой стадии хроматографии жидкую фазу пропускают через стиролдивинилбензольный сорбент с последующим элюированием раствором изопропилового спирта в уксусной кислоте, а на второй стадии полученный раствор элюата подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазном сорбенте в градиенте изопропилового спирта с добавкой органической кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование стиролдивинилбензольного сорбента осуществляют 10-12%-ным раствором изопропилового спирта в 0,1 М уксусной кислоте.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ВЭЖХ осуществляют при содержании изопропилового спирта в элюенте от 4,0 до 6,6% с добавкой в качестве органической лимонной или трифторуксусной кислоты.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ВЭЖХ проводят при линейной скорости элюента 1,9-2,5 см/мин и нагрузке по сырью 140-160 г на 1 кг сорбента.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обработки бусерелина-сырца используют 0,1 М раствор уксусной кислоты.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием бусерелина более 97% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что после осуществления ВЭЖХ, полученные фракции очищенного продукта с содержанием бусерелина от 30 до 97% подвергают концентрированию на сульфокатионите, элюированию и повторной очистке методом ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте, упариванию и лиофильному высушиванию.

РИСУНКИ