Патент на изобретение №2332235

(54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВАКЦИНАЦИИ ЦЫПЛЯТ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам контроля качества вакцинации сельскохозяйственной птицы против болезни Марека (БМ). Предложенный способ контроля качества вакцинации включает отбор проб и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие вакцинного вируса проводят в полимеразной цепной реакции, что позволяет более точно и в более ранние сроки контролировать качество вакцинации цыплят против болезни Марека и корректировать противоэпизоотические мероприятия. 4 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”polymerase chain reaction of Marek’s disease virus serotype 2 in field dust samples, feather tips and spleens. J Virol Methods. 2006 Aug; 135(2):186-91. Epub 2006 May 6.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам контроля качества вакцинации сельскохозяйственной птицы против болезни Марека (БМ).

Однако данный способ предназначен для выявления вируса болезни Марека в культуре клеток, либо патологическом материале от заболевших птиц и не используется для контроля вакцинации.

Недостаток данного способа в недостоверности контроля эффективности вакцинации по показателям гуморального иммунитета, т.е. титрам антител, так как иммунитет к болезни Марека преимущественно клеточный и напрямую зависит от наличия вакцинного штамма вируса болезни Марека в клетках организма. Таким образом, наличие антител к вирусу болезни Марека может свидетельствовать о контакте организма с его антигенами, но не дает гарантии что вирус сохранился в клетках птицы.

Технической задачей заявляемого решения является раннее обнаружение вакцинного штамма вируса болезни Марека в организме цыплят и повышение точности исследований.

Поставленная техническая задача решается тем, что в способе контроля качества вакцинации, включающем отбор проб и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, согласно изобретению, отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие вакцинного вируса проводят в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сущность изобретения заключается также в том, что для выявления геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вируса болезни Марека в ПЦР используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5′-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3′ (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5′-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3′ (сайт – отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).

Способ осуществляют следующим образом:

Материал: убитые с диагностической целью цыплята.

Отбор материала: пробы внутренних органов (например, печени) отбирают любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Традиционным способом производят выделение ДНК.

Для постановки ПЦР реакцию проводят по следующему температурному режиму (Табл.1).

В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5′-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3′ (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5′-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3′ (сайт – отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).

Продукты ПЦР разделяют методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе. Результаты ПЦР учитывают, визуализируя окрашенный бромистым этидием ПЦР-продукт (ампликон) в ультрафиолетовом свете. В случае положительной реакции в электрофорезе появляется фрагмент ДНК размером 358 п.н.

Для иллюстрации способа приведены примеры:

Пример 1. С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, данную реакцию ставили с геномной ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые могут присутствовать в организме птицы (Табл. 2).

Таким образом, в приведенном примере видна достаточная специфичность предложенной нами реакции.

Пример 2. Для оценки чувствительности метода была проведена серия десятикратных разведений вируссодержащего материала с начальной концентрацией 1000 БОЕ/мл. После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР с использованием заявляемого способа и ПЦР, приведенного в качестве аналога (см. табл.3).

Как следует из таблицы 3, чувствительность заявляемой в нашем способе ПЦР выше в 10 раз по сравнению с аналогичным методом. Этому способствуют 2 фактора – более короткий ампликон (синтезируемый фрагмент ДНК), что повышает эффективность протекания реакции и очень низкий уровень фона, что повышает эффективность использования компонентов реакции только для синтеза специфического ПЦР-продукта и позволяет использовать более высокие концентрации праймеров, не опасаясь появления неспецифических реакций.

Пример 3. Для оценки качества вакцинации птицы против БМ проведены следующие исследования.

Для исследований были отобраны цыплята 8-10-дневного возраста, привитые вакциной «бимарек» производства ВНИИЗЖ, из разных птицефабрик (6 групп). Цыплята были подвергнуты диагностическому убою, из проб печени выделили ДНК и тестировали на наличие вируса болезни Марека с использованием предложенной нами ПЦР. Параллельно из этих же птицефабрик были отобраны пробы крови от цыплят в возрасте 18 суток и поставлена ИФА (иммуноферментный анализ) на наличие антител к ВБМ. Разница в возрасте цыплят (8-10-ти суточные и 18-ти суточные) объясняется тем, что накопление и расселение вируса болезни Марека по организму происходит в более ранние сроки, чем последующая выработка антител к нему.

Анализ таблицы (Табл.4) показывает различный процент инфицированности цыплят ВБМ от 100 до 50%, кроме того, мы видим, что обнаружение антител не всегда сопровождается наличием вируса в организме. В подобной ситуации часть результатов ИФА, в аспекте контроля процента иммунной птицы, можно рассматривать как ложноположительные.

Таким образом, заявляемый способ позволяет более точно и в более ранние сроки контролировать качество вакцинации цыплят против болезни Марека и корректировать противоэпизоотические мероприятия. В связи с этим, мы можем считать целесообразным использование заявленной нами ПЦР с целью оценки качества вакцинации и выявления не иммунных к вирусу болезни Марека цыплят.

Формула изобретения

Способ контроля вакцинации цыплят против болезни Марека, включающий отбор и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, отличающийся тем, что отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие геномной ДНК вакцинного штамма вируса проводят в полимеразной цепной реакции с использованием праймеров со следующими нуклеотидными последовательностями: 5′-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3′ (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5′-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3′ (сайт отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).