Патент на изобретение №2332221

(54) ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОИНФЕКЦИОННЫХ ВЕЩЕСТВ

(57) Реферат:

Предложено применение крахмалов, замещенных присоединенными посредством линкера четвертичными аммониевыми группами со степенью замещения от 0,4 до 3,0, для лечения инфекционных заболеваний. Показано подавление репликации вируса простого герпеса типа 1 заявленными крахмалами при отсутствии противовирусного действия немодифицированных крахмалов. Минимальная ингибирующая концентрация для стафилококков и микобактерий составляла 5-60 г/л. Предполагается эффективность этих крахмалов для лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом или бактериями. 4 з.п. ф-лы, 7 табл.

Изобретение относится к применению веществ на основе олиго- и полисахаридов в качестве противоинфекционного средства, такого как антибактериальное и антивирусное средство. Это противоинфекционное средство может быть применено, например, в косметических и фармацевтических рецептурах в качестве консервантов, в лекарственных составах – в качестве биологически активного соединения, для биоцидной обработки поверхностей, тканей и упаковочных материалов, например, для пищевых продуктов или продуктов, используемых в медицине, биологии, фармации, и для защитного покрытия ран для использования в косметической и фармацевтической промышленности, в сельском хозяйстве, в пищевой промышленности и в производстве комбикормов.

Известно, что глобально возросло инфицирование бактериальными возбудителями болезней, и при этом антибактериальная невосприимчивость является главной проблемой здравоохранения. Всемирное увеличение туберкулезных инфекций микобактериальными штаммами, приобретающими с течением времени устойчивость к обычным терапевтическим средствам (смотри В.К.Bloom, J.L.Murray, Science 257, 1992, 1055), а также терапия инфекций полирезистентными стафилококками (М.Kresken, Bundesgesundheitsblatt 38, 1996, 170), требует разработки новых биологически активных веществ. Крайне необходимы альтернативные биологически активные вещества с новыми механизмами действия, особенно в отношении невосприимчивости к антибиотикам и лечения бактериальных инфекций при непереносимости в отношении существующих биологически активных веществ.

С развитием высокоселективных нуклеозидных и нуклеотидных вирусостатиков, таких как, например, ацикловир, пенцикловир, ганцикловир, зоривидин и цидофовир, для вируса герпеса, хотя и был достигнут прогресс в борьбе с угрожающей жизни инфекцией, однако названные терапевтические средства имеют один и тот же принцип действия. Они ингибируют вирусную ДНК-полимеразу. Другой недостаток этих соединений состоит в том, что они участвуют также в обмене веществ ДНК инфицированной клетки и поэтому таят в себе опасность вызвать мутагенное, тератогенное и онкогенное действие (Wutzler, P.Thust, R.Antiv. Res. 49, 2001, 55). Кроме того, при длительном применении нуклеозидных и нуклеотидных вирусостатиков как в инфицированных клеточных культурах, так и у пациентов с пониженным иммунитетом доказано развитие невосприимчивости к этим медикаментам (Andrei, G. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1995, 39 1632; Pavic, J. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1997, 39 2686). Следовательно, должны быть дополнительно разработаны новые высокоактивные антивирусные профилактические и терапевтические средства с другим механизмом действия.

Большую группу биологически активных веществ составляют четвертичные аммониевые соединения. Они могут уничтожать микроорганизмы, такие как бактерии и грибковые микроорганизмы. Низкомолекулярные четвертичные аммониевые соединения используют в качестве дезинфицирующих средств или биоцидных материалов для покрытий (J.Controlled Release 50, 1998, 145). Типичной проблемой низкомолекулярных соединений является недостаточное проявление биологической активности, например, в результате различных процессов миграции и расщепления. Полимерные четвертичные аминофункциональные вещества могут быть синтезированы из коммерческих четвертичных ионообменных смол графтполимеризацией полиуретанов с гидроксителехелатами полибутадиена или из полисилоксанов с первичными спиртовыми функциональными группами в боковой цепи. Эти биоцидные полимеры имеют чаще всего высокую стоимость производства и часто токсичны, так как содержат остатки токсичных мономеров (Trends in Polymer Science 4, 1996, 364). Кроме того, может происходить нежелательное и опасное накопление полимеров в организме, так как они биологически не разлагаются. Помимо этого синтетические полимеры, содержащие катионные функциональные группы, используют в виде дисперсий для защиты древесины (патент США US 5049383). Недостатком синтетических полимеров, содержащих катионные функциональные группы, является высокозатратное производство, токсичность (загрязнение остаточным содержанием мономеров) и устойчивость к биологическому расщеплению.

Производные полисахаридов с четвертичными аммониевыми функциональными группами известны и до сих пор используются прежде всего в качестве добавок для улучшения свойств поверхности в бумажной и текстильной промышленности, а также в косметике в качестве регулятора консистенции, причем они имеют лишь низкую степень замещения (DS), менее 0,2. Об их биологической активности до сих пор ничего не известно. С другой стороны, описывается противоинфекционное действие, особенно антибактериальное действие, простых эфиров крахмала, которые содержат длинные алкильные цепочки с 8-22 атомами углерода и соединены с крахмалом через силильные простые эфирные группы (заявка на патент Японии JP 05295002). Низкая химическая стабильность алкилсилильного простого эфира полисахаридов приводит к неконтролируемому высвобождению функциональных групп даже уже при воздействии влаги воздуха и в результате к снижению или потере биологической активности (D.Klemm et al., Comprehensive Cellulose Chemistry, Wiley-VCH, 1998). Кроме того, низкомолекулярные силильные соединения токсичны. Помимо этого ссылаются на публикации об антибактериальных целлюлозных волокнах и производных хитозана (W.H.Daly, M.M.Guerrini, Polym. Mat. Sci. Eng. 79, 1998, 220). Хитозан чаще всего описывается как природный катионный полисахарид и используется в качестве фунгицидного средства в косметике (Т.Tashiro, Macromol. Mater. Eng. 286, 2001, 63, К.С.Gupta, M.N.V.R. Kumar, J.M.S.-Rev. Macromol. Chem. Phys. C40, 2000, 273). Недостатками этого полисахарида являются частое загрязнение другими биогенными веществами, высокая стоимость вследствие затратных методов выделения и очистки и природная структура, локализирующая аммониевые группы исключительно на основной цепи полимера. Кроме того, их распределение является нерегулируемым, а содержание ограничено степенью замещения 1. Описан также суперабсорбер из катионно модифицированных и сшитых полисахаридов, таких как целлюлоза (европейская заявка на патент ЕР 0582624 В1).

В литературе имеются данные, что биологическая активность определяется наличием четвертичных аммониевых групп, причем, с другой стороны, описывается, что типичные соединения с катионными четвертичными алкилзамещенными аминогруппами, такие как Поликватерниум 10, как доказано, не обладают биоактивностью (W.A.Daly, M.M.Guerrini, D.Culberson, J.Macossay, Science and Technology of Polymers and Advanced Materials, Plenum Press, 1998, 493). Из имеющихся литературных сведений никоим образом нельзя прийти к выводу, являются ли и такие структуры на самом деле биологически активными.

В основу изобретения положена задача найти полимеры с новым видом противоинфекционного действия, причем вещества должны обладать эффективным противоинфекционным действием широкого спектра, позволять эффективную борьбу с невосприимчивостью к антибиотикам при бактериальных инфекциях, предоставлять новые возможности для терапии вирусных инфекций, а также являться хорошо переносимыми, биологически разлагаемыми, нетоксичными и получаемыми простым способом.

Согласно изобретению задача решается получением производных полисахаридов, у которых посредством реакции этерификации с образованием простых эфиров введены катионные функциональные группы со степенью замещения (DS) в пределах от 0,4 до 3,0, в особенности алкиламмониевые группы со степенью замещения в пределах от 0,6 до 1,8 через спейсерные группы. Полисахариды особенно пригодны благодаря их биологической разлагаемости и нетоксичности.

В соответствии с этим изобретение относится к применению полисахаридов, замещенных на связанные посредством линкера четвертичные аммониевые группы со степенью замещения от 0,4 до 3,0, в качестве противоинфекционного средства или для лечения инфекционных заболеваний.

Используемые согласно изобретению соединения обладают высокой биологической активностью и неожиданным образом ингибируют рост патогенных бактерий, таких, например, как стафилококки и микобактерии, при минимальной ингибирующей концентрации в пределах 5-60 мг/л, а также ингибируют размножение вирусов герпеса и гриппа при концентрации в пределах 3-50 мг/л. Благодаря своим свойствам соединения могут использоваться для изготовления лекарственных средств, предназначенных для предотвращения и лечения бактериальных и вирусных инфекций. Они могут применяться как самостоятельно, так и в комбинации с известными терапевтическими средствами или физиологически совместимыми вспомогательными веществами и веществами-носителями.

Противоинфекционные соединения могут приготавливаться для использования в качестве раствора или суспензии в фармацевтически приемлемых средах для локального или парентерального нанесения посредством внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекций, для внутриназального нанесения; в качестве таблеток, капсул или суппозиториев. Соединения могут использоваться в дозах 0,1-1000 мг/кг массы тела.

Для получения биологически активных соединений по изобретению используют полисахариды, предпочтительно полиглюканы, такие как целлюлоза, лихенин, пуллулан, декстран и, особенно предпочтительно крахмалы, такие как природные крахмалы различного происхождения, например картофельный, пшеничный, маисовый и рисовый крахмал, и химически или энзиматически частично гидролизованные крахмалы, такие как соламил (Solamy), амилоза, амилопектин и крахмал восковидной кукурузы, а также крахмалы, получаемые из генетически измененных растений, такие как крахмал марки Hylon. Содержание амилозы, так же как и амилопектина, в крахмале составляет соответственно от 0 до 100%, предпочтительно 30-70%. Молекулярная масса пригодных полисахаридов находится в пределах 10³-10⁷ г/моль (смотри Таблицу 1). Ангидроглюкозное звено – повторяемость звеньев (AGU) может быть схематически изображена через связи: (1-4), (1-6), (1-3), (1-4) и (1-3) или также через их комбинацию, как, например, (1-4) и (1-6) (смотри структуру формулы (А)), либо (1-6), (1-3) и (1-4) могут быть связаны друг с другом и содержать различной длины и связанные боковые звенья. Кроме того, могут содержаться также другие функциональные группы, такие как сложно эфирные фосфатные группы, например, у природного картофельного крахмала.

Структуры используемых полисахаридов могут быть представлены, например, формулой (А).

Степень взаимодействия гидроксильных групп характеризуется средней степенью замещения (DS). Этот средний показатель определяет без какого-либо дифференцирования число функциональных гидроксильных групп и, следовательно, он находится у названных полисахаридов согласно определению в пределах от 0 до 3. Степень замещения (DS) катионными группами производных полисахаридов с противоинфекционной активностью по изобретению находится в пределах между 0,4 и 3,0, предпочтительно между 0,6 и 1,8. В случае введения в процессе получения производных функциональных групп, которые сами содержат реакционноспособные группы, например, гидроксильных групп в результате образования простых эфиров полисахаридов с эпоксидами, такие группы могут также реагировать с образованием более длинных боковых цепей.

Используемые по изобретению производные полисахаридов известны или могут быть получены известным способом, в особенности посредством образования простых эфиров полисахаридов с реакционноспособными соединениями, в результате чего либо образуются непосредственно четвертичные аммониевые соединения общей формулы (I) (PS: радикал полисахарида, обнаружен лишь один заместитель), либо кватернизацию осуществляют непосредственно после реакции образования простого эфира. В формуле (I) R₁, R₂ и R₃ независимо друг от друга могут являться предпочтительно алкилом с 1-4 атомами углерода или бензилом либо замещенным бензилом (заместители, например, могут присутствовать в количестве от 1 до 3-х и представляют собой алкил, галоген, алкокси, карбамоил, алкоксикарбонил, циано, диалкиламино). R₁ может быть также водородом, а Х является анионом (например, галогенидом, гидроксильной группой, сульфатом, гидросульфатом и другим анионом минеральных карбоновых кислот), n может означать 2-4.

Предпочтительно используемыми реагентами, приводящими к образованию четвертичных катионных групп, являются 2,3-эпоксипропилтриметиламмонийхлорид (QUAB^® 151, Degussa AG, формула II) или 3-хлор-2-гидроксипропилтриметиламмонийхлорид (QUAB^® 188, Degussa AG, формула III). Для образования простых эфиров полисахаридов можно использовать также реагенты общей формулы IV, где Y означает хлор, бром и n равно 1-3.

В соответствии с этим речь идет о линкере, посредством которого четвертичные аммониевые группы связываются с полисахаридом, о при необходимости замещенных гидроксилом алкиленах с 2-4 атомами углерода.

Образование простых эфиров для получения биологически активных производных полисахаридов может проводиться различным образом и осуществляться известным способом, причем достигается высокое содержание катионных групп. Пригодны как суспензии полимеров в спирте и едком натрии и воде (гетерогенный способ), причем в качестве реакционной среды пригодны спирты, такие как метанол, изопропанол и предпочтительно этанол, или водные щелочные растворы, предпочтительно едкий натрий/вода с переходом от гомогенной системы к гетерогенной, так и гомогенные растворы полимеров в биполярных апротонных растворителях, таких как диметилсульфоксид или диметилацетамид, в присутствии хлорида лития или другие растворители. Время взаимодействия с катионизирующим реагентом находится в пределах между 1 и 48 часами, предпочтительно от 3 до 24 часов, а температура – между 30 и 130°С, предпочтительно от 40 до 80°С. Посредством использования молярного эквивалента агента, используемого для образования простого эфира, можно дополнительно регулировать степень замещения продукта и варьировать ее в широких пределах. Для получения производных полисахаридов пригодны, кроме того, многоступенчатые реакции, когда уже канонизированный аминофункционализированный продукт снова подвергают взаимодействию в вышеназванных условиях. Обработку продукта реакции осуществляют обычным способом химии полимеров, причем низкомолекулярные побочные продукты и остатки реагентов отделяют диализом или промывкой или переосаждением из воды в органический растворитель.

Степень замещения рассчитывают посредством найденного элементным анализом среднего азотного показателя по следующей формуле:

Кроме того, для определения степени замещения (DS) пригодны содержащиеся в соединениях противоионы, такие как хлорид, и ЯМР-спектры.

Нижеследующие примеры осуществления служат более подробному пояснению изобретения, однако они не должны ограничивать изобретение.

Примеры осуществления изобретения

1. Получение соединений по гетерогенной реакции в среде этанол/едкий натр/вода

20 г полисахарида (вид полисахарида смотри в нижеследующей Таблице 2) суспендируют в 80 мл этанола. К этой суспензии по каплям прибавляют раствор 10,85 г едкого натрия в 28 мл воды и 80 мл этанола, а также раствор 0,246 моль QUAB^® 188 (69%-ный водный раствор). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 6 часов. Продукт нейтрализуют 0,1 н. HCl, подвергают диализу и сушат вымораживанием.

Выход продукта составил 95% (на достигнутую степень замещения).

Элементный анализ: N % 3,51.

Средняя степень замещения (DS_N)=0,66

2. Взаимодействие полисахаридов в водном растворе едкого натрия

20 г полисахарида (вид полисахарида смотри в нижеследующей Таблице 3) суспендируют в растворе едкого натрия (0,5 г едкого натрия в 100 мл воды). Смесь перемешивают при 60°С. При этой температуре по каплям прибавляют 0,123 моль QUAB^® 151 или в случае расщепленного крахмала Solamyl прикапывают QUAB^® 188. Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь нейтрализуют 0,1 н. HCl; затем подвергают диализу и сушат вымораживанием.

Выход продукта составил 98% (на достигнутую степень замещения).

Элементный анализ: N % 3,34.

Средняя степень замещения (DS_N)=0,60.

3. Гомогенная реакция в диметилсульфоксиде (ДМСО)

15 г полисахарида (вид полисахарида смотри в нижеследующей Таблице 4) суспендируют в диметилсульфоксиде (ДМСО) при комнатной температуре и нагревают до 80°С, при этом полисахарид растворяется. Раствор охлаждают до комнатной температуры и прибавляют 0,5 г едкого натрия, растворенного в 20 мл воды. Затем при перемешивании прикапывают 0,0925 моль QUAB^® 151. Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 24 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь нейтрализуют 0,1 н. HCl, а затем подвергают диализу и сушат вымораживанием.

Выход продукта составил 99% (на достигнутую степень замещения).

Элементный анализ: N % 3,22.

Средняя степень замещения (DS_N)=0,57

4. Катионизирование в несколько стадий

5 г катионизированного полисахарида (вид полисахарида смотри в нижеследующей Таблице 5) суспендируют в растворе едкого натрия (0,5 г едкого натрия в 100 мл воды). Смесь перемешивают при 60°С в течение одного часа. При этой температуре прикапывают 0,2 моль QUAB^® 151. Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь нейтрализуют 0,1 н. HCl, а затем подвергают диализу и сушат вымораживанием.

Выход продукта составил 95% (на достигнутую степень замещения).

Элементный анализ: N % 5,11.

Средняя степень замещения (DS_N)=1,32

5. Определение антибактериальной/антимикробной активности соединений в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжей

Антибактериальная активность соединений в отношении Staphylococcus aureus SG 511, S.aureus 134/93 (полиустойчивые) и Mycobacterium vaccae IMET 10670 испытывали посредством определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) в испытании с разведением в микробульоне Мюллера-Хинтона (DIFCO) в соответствии с рекомендациями NCCLS [National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for dilution antim-icrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; 4^th Ed.; Villanova, Ed.; Approved standard Document M7-A4. NCCLS, (1997)]. Результаты представлены в Таблице 6.

6. Определение противовирусного действия в отношении вируса простого герпеса типа 1 (ВПГ-1)

Перед испытанием противовирусной активности определяли 50%-ную цитотоксичную концентрацию (CC₅₀) в клетках почки зеленой обезьяны (ЗОП) для того, чтобы можно было исключить неспецифичные действия вещества. Для этого клетки ЗОП засевают в микротитерные пластины с серией разбавленного вещества (фактор 2) (Schmidtke et al.; J.Virol Meth. 95, 2001, 133). После 72 часов инкубации осуществляли окрашивание клеток раствором красителя кристаллический фиолетовый в метаноле. После выделения из раствора красителя измеряют оптическую плотность отдельных углублений в пластинчатом фотометре фирмы Dynatech (550/630 нм) и сравнивают со средним показателем шести необработанных контрольных образцов клеток, который принимают за 100%. CC₅₀ представляет собой концентрацию вещества в точке пересечения кривой экстинкции серии разбавлений с 50%-ной линией среднего показателя контроля. Противовирусное действие соединений в отношении ВПГ-1 испытывали в тесте на цитопатический эффект инибирования (zpE-Hemmtest) в клетках почки зеленой обезьяны и определяли 50%-ную дозу ингибирования (IC₅₀) (Schmidtke et al.; J.Virol Meth. 95, 2001, 133). Рассчитывали индекс селективности как частное от СС₅₀ и IC₅₀ (Таблица 7). Исходные соединения (QUAB-реагенты или немодифицированные крахмалы) не показали никакого противовирусного действия (результаты не представлены).

7. Определение механизма действия в модифицированном тесте для определения уменьшения пятен (plaque reduction test)

Исследование механизма действия вещества проводили с чувствительным к ацикловиру и фосфономуравьиной кислоте ВПГ-1 штаммом Kupka в модифицированном тесте для определения уменьшения пятен, например, с соединением М 1 (Schmidtke et al.; J.Virol Meth. 95, 2001, 133). При этом осуществляли добавление вещества в различных концентрациях:

1. только к не содержащему клеток вирусу (10⁶ pfu/ml), который затем инкубировали с соединением при температуре 37°С в течение 6 часов и использовали после разведения вещества в тесте для определения уменьшения пятен: отсутствие уменьшения тромбоцитов в области доз 6,25-25 мкг/мл (результаты не представлены);

2. только в агар: отсутствие уменьшения тромбоцитов в области доз 6,25-25 мкг/мл (результаты не представлены);

3. только во время одночасовой адсорбции при 4°С в течение 2 часов (3,12-12,5 мкг/мл) и

4. 1,2 и 4 часа перед добавлением вируса (3,12-12,5 мкг/мл).

Результаты исследований механизма действия показывают, что соединения по изобретению не действуют на вирус, так как инактивирование не содержащего клеток вируса не могло быть установлено. Условием для ингибирования репликации (воспроизведения) вируса герпеса является, скорее, присутствие вещества перед или во время адсорбции вируса на испытуемых клетках.

Формула изобретения

1. Применение крахмалов, замещенных присоединенными посредством линкера четвертичными аммониевыми группами со степенью замещения от 0,4 до 3,0, для лечения инфекционных заболеваний.

2. Применение крахмалов по п.1, причем степень замещения составляет от 0,6 до 1,8.

3. Применение крахмалов по п.1, причем представляют собой вещества, такие как картофельный, пшеничный, маисовый и рисовый крахмалы, химически или энзиматически частично гидролизованный крахмал или крахмал, полученный из генетически измененных растений.

4. Применение крахмалов по п.1, причем линкерами, посредством которых четвертичные аммониевые группы связаны с полисахаридом, являются, при необходимости, замещенные гидроксильной группой алкиленовые группы с 2-4 атомами углерода.

5. Применение крахмалов по п.1 для лечения вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний.

PD4A – Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

Дау Вольфф Целлулосикс ГмбХ (DE)

Адрес для переписки:

105064, г. Москва, а/я 88, ООО “Патентные поверенные Квашнин, Сапельников и партнеры”

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009

PC4A – Регистрация договора об уступке патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Дау Вольфф Целлулосикс ГмбХ (DE)

(73) Патентообладатель:

Дау Глобэль Текнолоджис Инк. (US)

Договор № РД0058633 зарегистрирован 23.12.2009

Извещение опубликовано: 10.02.2010 БИ: 04/2010