Патент на изобретение №2332172

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АТИПИЧЕСКОЙ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ АДЕНОМЫ И ФОЛЛИКУЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ обеспечивает повышение точности послеоперационной дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы за счет дополнительного определения индексов мечения цитоплазмы клеток для каждого из белков Bc1-2 и р53. Производят взятие материала опухоли пациента, удаленной во время операции, приготовление срезов опухоли для иммуногистохимического анализа. На срезах опухоли определяют экспрессию белков Ki-67, Bc1-2 и р53 в ядрах клеток с помощью специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном. При этом определяют для каждого белка индекс мечения ядер клеток, который осуществляют по следующей процедуре: подсчитывают как среднюю долю клеток с окрашенными хромогеном ядрами в гистологических срезах, обработанных одним из специфических моноклональных антител, оцененную по 30 полям зрения и выраженную в процентах, причем дополнительно по той же процедуре определяют индексы мечения цитоплазмы клеток для белков Bс1-2 и р53, оценивают коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле:

КПВПА=(ИМя_вс1-2/ИМя_р53)·ИМя_Кi-67,

где КПВПА – коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности, ИМя_Вс1-2, ИМя_р53, ИМя_Кi-67 – индексы мечения ядер клеток опухоли для каждого из белков Вс1-2, р53 или Ki-67 соответственно; оценивают коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношение индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Bс1-2 к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка р53; определяют коэффициент активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности (КАОРЗ) как произведение коэффициента возможной атипии цитоплазмы (КВА) и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности и при величине 0КАОР34,35 диагностируют атипическую фолликулярную аденому, а при величине КАОР3>4,36 – фолликулярный рак. 4 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”рака щитовидной железы и ее клиническое значение. БМЖ, 2003 [он-лайн], найдено 29.10.2007, найдено из Интернет www.bsmu.by/bmm/01.2003/16.html. БЕЛОКРИНИЦКАЯ Т.Е. и др. Фактор некроза опухолей А и трансформирующий фактор роста В в регуляции апоптоза и пролифирации клеток при дисплазии и раке шейки матки, ж. Цитокины и воспаление, 2006, т.5, № 1, с.31-33. ALMUDEVAR E. et al. Applicacion de las oncoproteinas P21ras, P53, bc1-2 y del factor de proliferacion celular Ki-67 (MIB-1) en el diagnostico de tumores tiroideos., 2000, Anales del Sistema Sanitario de Navarra., Volume 23, Issue 2, p.247-255.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы на послеоперационной стадии. Это имеет важное значение для выбора одной из программ дальнейшего лечения пациента, которые чрезвычайно различаются по объему и последствиям в зависимости от вида опухоли.

Известен способ дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы, включающий забор материала опухоли щитовидной железы пациента путем вырезания фрагментов ткани опухоли, удаленной во время операции; приготовление препаратов для морфологического анализа – стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартная окраска для гистологического исследования; определение наличия соединительнотканной капсулы, выраженной пролиферации эпителия, клеточной атипии (единичные участки, умеренная), определение средних величин внешнего и внутреннего диаметров фолликула, средней величины относительной площади сосудов, средней величины относительной площади фиброзирования; при наличии соединительнотканной капсулы, выраженной пролиферации эпителия, средней величине внутреннего диаметра фолликула 12,00-13,2 мкм, средней величине внешнего диаметра фолликула 26,1-28,5 мкм, средней величине относительной площади сосудов не более 5,7% и средней величине относительной площади фиброзирования 17,4-18,0 делают заключение о фолликулярной аденоме; при наличии соединительнотканной капсулы, выраженной пролиферации эпителия, единичных участков клеточной атипии, средней величине внутреннего диаметра фолликула не более 11,0 мкм, средней величине внешнего диаметра фолликула не более 23,2 мкм, средней величине относительной площади сосудов 6,5-6,9%, средней величине относительной площади фиброзирования не более 14,4% – об атипической фолликулярной аденоме; при наличии соединительнотканной капсулы, выраженной пролиферации эпителия, умеренно выраженной клеточной атипии, средней величине внутреннего диаметра фолликула не более 12,3-13,0 мкм, средней величине внешнего диаметра фолликула 25,6-26,5 мкм, средней величине относительной площади сосудов не менее 7,6%, средней величине относительной площади фиброзирования 23,6-24,0% – о фолликулярном раке; при наличии выраженной пролиферации эпителия, единичных участков с папиллярными структурами, наличии умеренного полиморфизма клеток и ядер и умеренной клеточной атипии, средней величине внутреннего диаметра фолликула не менее 16,1 мкм, средней величине внешнего диаметра фолликула не менее 31,7 мкм, средней величине относительной площади сосудов 5,7-6,0%, средней величине относительной площади фиброзирования не менее 25,9% – о фолликулярном варианте папиллярного рака (1). Недостатком известного способа является субъективность в оценке степени выраженности таких морфологических признаков фолликулярных опухолей щитовидной железы как пролиферация эпителия, полиморфизм клеток и ядер, клеточная атипия, что ставит в зависимость точность диагностики от опыта врача, при этом наибольшие трудности вызывает у специалистов дифференциальная диагностика атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы.

Известен способ дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы, включающий взятие материала опухоли пациента, удаленной во время операции, приготовление срезов опухоли для иммуногистохимического анализа, определение экспрессии белков Ki-67, Bc1-2, p53 в ядрах клеток опухоли с помощью специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном, подсчет для каждого белка индекса мечения как средней доли окрашенных хромогеном ядер клеток в гистологических срезах опухоли, оцененной по 30 полям зрения, выраженной в процентах; при величине ИМя_Вс1-2 – 8,4±0,4, ИМя_p53 – 31,4±1,2 делают заключение о фолликулярной аденоме; при ИМя_Bc1-2 – 12,6±1,1, ИМя_р53 – 13,6±0,9 – об атипической фолликулярной аденоме; при величине ИМя_Bс1-2 – 16,8±1,2, ИМя_р53 – 12,8±0,7 – о фолликулярном раке; при величине ИМя_Ki-67 – 34,1±1,3, ИМя_Bс1-2 – 32,0±1,1, ИМя_р53 – 33,8±1,4 – о фолликулярном варианте папиллярного рака щитовидной железы (2). Данный способ позволяет провести дифференциальную диагностику по объективным признакам, не зависящим от опыта врача.

Недостатком известного способа является то, что он не обладает необходимой точностью при дифференциальной диагностике атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака, т.к. различия индексов мечения ядер клеток для белков Bc1-2 и p53, присутствующих в этих видах опухолей, недостаточно статистически значимы. Это обусловлено тем, что недостаточно учитывать только ядерную локализацию белков Bc1-2 и p53, т.к., например, ядерная локализация онкопротеина Bc1-2 может соответствовать его неактивной, фосфорилированной форме, не способной блокировать апоптоз и приводить к развитию злокачественной опухоли (3).

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение точности послеоперационной дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака. Решение поставленной задачи достигается тем, что дополнительно определяют индексы мечения цитоплазмы клеток для каждого из белков Вс1-2 (ИМц_Bс1-2) и р53 (ИМц_р53); оценивают коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле:

КПВПА=(ИМя_Bс1-2/ИМя_р53)·ИМя_Ki-67,

где КПВПА – коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности, ИМя_Bс1-2, ИМя_р53, ИМя_Ki-67 – индексы мечения ядер клеток опухоли для каждого из белков Вс1-2, р53 или Ki-67 соответственно; оценивают коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношение индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Вс1-2 (ИМц_Bс1-2) к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка р53 (ИМц_p53); определяют коэффициент активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности опухоли (КАОРЗ) как произведение коэффициента возможной атипии цитоплазмы (КВА) и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности; при величине 0КАОРЗ4,35 делают заключение об атипической фолликулярной аденоме; при величине КАОРЗ>4,36 – о фолликулярном раке.

Описание изобретения

Способ дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы включает:

1. Взятие материала опухоли щитовидной железы, удаленной во время операции, путем вырезания фрагментов ткани опухоли.

2. Приготовление срезов опухоли для иммуногистохимического анализа, включающее фиксацию образцов опухолей в 10%-ном нейтральном растворе формалина, обезвоживание в серии растворов этилового спирта и заключение в парафин; приготовление стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартная окраска (например, гематоксилином и эозином).

3. Определение наличия (экспрессии) белков Ki-67, Вс1-2, р53 в ядрах и белков Вс1-2, р53 – в цитоплазме клеток опухоли с помощью специфических моноклональных антител к каждому из онкогенных белков в комплексе с хромогеном. Хромоген окрашивает («метит») ядра и/или цитоплазму клеток, в которых произошла реакция моноклонального антитела с соответствующим ему белком при наличии последнего в ядре и/или цитоплазме клетки. В качестве хромогена можно использовать, например, диаминобензидан, окрашивающий ядра и/или цитоплазму клеток в коричневый цвет. Каждый срез опухоли обрабатывают только одним из моно-клональных антител в комплексе с хромогеном, т.к. окраска клеток с помощью хромогена в один цвет не позволяет различать присутствие одновременно двух и более белков на одном срезе опухоли.

4. Подсчет для каждого белка Ki-67, Bc1-2, p53 индексов мечения ядер (ИМя), а для белков Bc1-2, p53 также индексов мечения цитоплазмы (ИМя) клеток, специфично окрашенных хромогеном. Индексы мечения ядер (ИМя) или цитоплазмы (ИМц) определяют как среднюю долю клеток с окрашенными хромогеном ядрами или соответственно цитоплазмой в гистологических срезах, обработанных одним из специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном, оцененную по 30 полям зрения и выраженную в процентах. Данная процедура может быть осуществлена автоматически с помощью системы анализа изображения, состоящей из микроскопа проходящего света (например, “AxioStar+” фирмы Carl Zeiss), цветной видеокамеры (например, “JVC”), компьютера (например, Pentium IV IBM) и программы компьютерной морфометрии (например, AxioVision 3.1); выбор объектов для подсчета осуществляют автоматически по цвету с 24-битной градацией глубины цветности.

5. Подсчет коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле:

КПВПА=(ИМя_Bс1-2/ИМя_р53)·ИМя_Ki-67,

где КПВПА – коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности, ИМя_Bс1-2, ИМя_р53, ИМя_Ki-67 – индексы мечения ядер клеток, оцененные после обработки гистологического среза опухоли комплексом хромогена с моноклональным антителом к соответствующему белку Bc1-2, p53 или Ki-67.

6. Оценка коэффициента возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношения индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Bc1-2 (ИМц_Bc1-2) к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка p53 (ИМц_р53), а именно: КВА=ИМц_Bc1-2/ИМц_р53.

7. Имея в наличии два показателя – коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности (КПВПА), связанный с процессами размножения опухолевых клеток и процессами опухолевой прогрессии, и коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА), свидетельствующий о степени ее изменений в клетках, и учитывая их однонаправленность, можно их интегрировать, для вычисления общего показателя – коэффициента активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности опухоли (КАОРЗ) как произведения коэффициента возможной атипии цитоплазмы и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности, а именно: КАОРЗ=КВА·КПВПА.

8. При величине 0КАОР34,35 делают заключение об атипической фолликулярной аденоме; при величине КАОРЗ>4,36 – о фолликулярном раке.

Для упрощения расчетов эквивалентная формула КАОРЗ может быть выражена через индексы мечения ядер и цитоплазмы, а именно:

КАОРЗ=(ИМя_Ki-67·ИМя_Bс1-2·ИМц_Bс1-2)/(ИМя_р53·ИМц_р53).

Перечень фигур чертежей и иных материалов

Таблица 1. Индекс мечения ядер клеток для белков Ki-67, Bc1-2 и р53 в срезах ткани атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы (М±m).

Таблица 2. Индекс мечения цитоплазмы клеток для каждого из белков Bc1-2 и р53 в срезах ткани атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы (М±m).

Таблица 3. Средние величины коэффициентов потенциальной возможности к пролиферативной активности, возможной атипии цитоплазмы и активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности для различных видов фолликулярных опухолей щитовидной железы (М±m).

Таблица 4. Интервалы величин КПВПА, КВА и КАОРЗ для атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы.

Примеры конкретного выполнения

Исследованы гистологические срезы операционного материала из опухолевых образований 165 больных, оперированных по поводу фолликулярной опухоли щитовидной железы. Взятие материала и приготовление препаратов для гистологического и иммуногистохимического анализа – согласно заявленному способу. Каждый срез опухоли обрабатывали моноклональными антителами только к одному из онкогенных белков.

У каждого пациента исследовано 30 полей зрения в гистологических срезах опухоли. С помощью системы анализа изображения, состоящей из микроскопа проходящего света “AxioStar+” фирмы Carl Zeiss, цветной видеокамеры “JVC”, компьютера Pentium IV IBM и программы компьютерной морфометрии AxioVision 3.1, проанализированы величины индекса мечения ядер согласно заявленному изобретению.

В качестве хромогена использовали диаминобензидан. В каждом из полей зрения производили раздельный подсчет доли клеток, в которых ядра специфично окрашены в коричневый цвет, а также количества клеток с окрашенной цитоплазмой по отношению к каждому из экспрессирующих белков. Выбор объектов для подсчета осуществлялся автоматически по цвету с 24-битной градацией глубины цветности.

С помощью программ статистической обработки проведен математический анализ полученных параметров и определены средние арифметические ошибки репрезентативности, минимальные и максимальные величины изученных параметров, среднее отклонение, среднее квадратичное отклонение (вариабельность). Достаточный объем выборки определяли по критерию «достаточная точность среднего», которая не превышала 5%. Проведение параметрического сравнения полученных массивов данных для определения вероятности достоверности отличий проводили по тесту Колмогорова-Смирнова (р<0,05).

В таблицах 1-3 приведены для сравнения величины индекса мечения ядер по отношению к белкам Ki-67, Bc1-2, p53 и индексы мечения цитоплазмы клеток по отношению к белкам Bc1-2, p53 различных видов фолликулярных опухолей щитовидной железы, коэффициенты потенциальной возможности к пролиферативной активности (КПВПА), коэффициенты возможной атипии цитоплазмы (КВА) и коэффициенты активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности опухоли (КАОРЗ) у вышеуказанных 165 больных, подсчитанные согласно заявленному способу. Как видно из таблицы 3, атипическая фолликулярная аденома и фолликулярный рак отличаются по приведенным в таблице средним величинам КПВПА, КВА и КАОРЗ как между собой, так и от других видов фолликулярных опухолей щитовидной железы. Различия между атипической фолликулярной аденомой и фолликулярным раком выражены в большей степени и дают меньший статистический разброс по сравнению с индексом мечения ядер клеток, что позволяет повысить точность диагностики. Как видно из таблицы 4, атипическая фолликулярная аденома и фолликулярный рак щитовидной железы различаются и по интервалам величин КПВПА, КВА и КАОРЗ, что позволяет с большей надежностью осуществлять их дифференциальную диагностику в сравнении с прототипом. Кроме того, заявленные существенные признаки являются объективными и сводят к минимуму возможность диагностической ошибки, обусловленной недостаточным опытом специалиста (врача). Результаты диагностики по заявленному способу подтверждены результатами независимой экспертизы тех же материалов высококвалифицированными специалистами в данной области на основании гистологического анализа.

Примечание: Границы интервалов величин определяли по формуле:

(Мфр-Мафа)/2+Мафа.

где М_афа – средняя арифметическая величина соответствующего коэффициента у больных атипической фолликулярной аденомой; М_фр – то же у больных фолликулярным раком.

Получены следующие их значения: для КВА – 0,545; для КАОРЗ – 4.35; для КПВПА – 7,7.

Список литературы

3. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей. / Казань, 2004. – С.350-365.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы, включающий взятие материала опухоли пациента, удаленной во время операции, приготовление срезов опухоли для иммуногистохимического анализа, определение экспрессии белков Ki-67, Bc1-2, р53 в клетках опухоли с помощью специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном, при этом определяют для каждого белка индекс мечения ядер клеток, который осуществляют по следующей процедуре: подсчитывают как среднюю долю клеток с окрашенными хромогеном ядрами в гистологических срезах, обработанных одним из специфических моноклональных антител, оцененную по30 полям зрения и выраженную в процентах, отличающийся тем, что дополнительно по той же процедуре определяют индексы мечения цитоплазмы клеток для белков Bс1-2 и р53, оценивают коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле

КПВПА=(ИМя_Вс1-2/ИМя_р53)·ИМя_Кi-67,

где КПВПА – коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности, ИМя_Вс1-2, ИМя_р53, ИМя_Кi-67 – индексы мечения ядер клеток опухоли для каждого из белков Вс1-2, р53 или Ki-67 соответственно; оценивают коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношение индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Bc1-2 к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка р53; определяют коэффициент активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности (КАОРЗ) как произведение коэффициента возможной атипии цитоплазмы (КВА) и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности и при величине 0КАОР3<4,35 диагностируют атипическую фолликулярную аденому, а при величине КАОРЗ>4,36 – фолликулярный рак.