Патент на изобретение №2331889

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической биохимии. В слезе у больного определяют ферменты-показатели холестаза: щелочную фосфатазу (ЩФ), -глутамилтранспетидазу (-ГТП), лейцинаминопептидазу (ЛАП). При значении активности ЩФ, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), -ГТП, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), ЛАП, равном и выше – 52,5 Е/л, диагностируют механический характер желтухи. Способ позволяет исключить инвазивный компонент в лабораторной диагностике желтух, упрощает проведение анализа и ускоряет диагностику. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно клинической биохимии, и может быть использовано для неинвазивной диагностики механической желтухи.

Известны способы диагностики холестаза, вызванного механической желтухой, по ферментному анализу крови, уровню билирубинемии (Р.Г.Хачатрян, Б.И.Альперович. Механическая желтуха. – Томск, издательство томского университета, 1994. – 304 с.).

Все эти методики связаны с забором крови у пациентов, что является инвазивной процедурой.

Технический результат: исключение инвазивного компонента путем разработки неинвазивного способа диагностики механической желтухи, ускорение, упрощение способа.

Указанный результат достигается путем замены исследуемой среды: вместо анализа крови, забранной из вены, проводят анализ слезной жидкости, в которой определяют показатели холестаза, и при значении щелочной фосфатазы, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), -глутамилтранспептидазы, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), лейцинаминопептидазы 52,5 Ед/л диагностируют механическую желтуху.

Способ осуществляют следующим образом: слезу у больного для исследования получают по методу, разработанному Терехиной Н.А. (Терехина Н.А., Петрович Ю.А., Батуева Р.А. Влияние метода сбора слезной жидкости на ее состав. / Лабораторное дело, 1989. – № 6. – С.27-30), который заключается в следующем: после поднесения к носу ваты, смоченной 10% раствором нашатырного спирта, собирают чистой пипеткой выделившуюся слезу у наружного угла глаза. Процесс забора слезы технически проще и быстрее, чем забор крови из вены.

Определяют в слезной жидкости активность лейцинаминопептидазы, щелочной фосфатазы, -глутамилтранспептидазы.

Количественное определение лейцинаминопептидазы (ЛАП) проводят кинетическим методом по Nagel [Nagel W et al. Klin Wschr 1964; 42: 446-469].

Принцип метода: содержащаяся в пробе ЛАП расщепляет 1-лейцил-р-нитроанилид до 1-лейцина и р-нитроанилида. Уровень образовавшегося 1-лейцина, измеренный фотометрически, пропорционален уровню ЛАП в исходной пробе.

Реагенты: набор реактивов «Quantitative determination of leucine aminopeptidase (LAP)» фирмы «SPINREACT, S.A.» – Испания.

1. Буферный раствор рН 7,2 – фосфат (100 ммоль/л).

2. Субстрат – 1-лейцил-р-нитроанилид (0,8 ммоль/л) растворяют в буферном растворе.

Приготовленный раствор стабилен 7 дней при температуре 2-8°С или 48 часов при комнатной температуре (15-25°С).

Ход работы: приготовленный раствор вносят в пробирки в объеме 1,5 мл. Затем добавляют исследуемую среду (слезу) в объеме 0,1 мл. Содержимое пробирки перемешивают и измеряют оптическую плотность через 1 минуту. Затем измеряют увеличивающуюся оптическую плотность ровно через 1, 2 и 3 минуты. Измерение проводится с помощью спектрофотометра PD-303 против воды при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см. Температура исследования 37°С.

Рассчитывают среднее изменение оптической плотности за минуту (А/мин). Коэффициент для перевода полученных результатов в международные единицы: А/мин × 1544=Ед/л ЛАП.

Количественное определение щелочной фосфатазы (ЩФ) проводят унифицированным методом по «конечной точке».

Принцип метода: содержащаяся в пробе ЩФ фосфатаза расщепляет п-нитрофенилфосфат в присутствии воды до п-нитрофенола и фосфата. Уровень образовавшегося п-нитрофенола, измеренный фотометрически, пропорционален уровню ЩФ в исходной пробе.

Реагенты: набор реактивов «Alcalin Phosphatase “FL”» фирмы «VITAL DIAGNOSTICS, SPb.» – Россия.

Реактив № 1. Глициновый буфер рН 10,4 – глицин (55 ммоль/л).

Реактив № 2. Раствор едкого натра (200 ммоль/л) разводят дистиллированной водой в 10 раз. Приготовленный раствор стабилен в плотно закрытой посуде.

Реактив № 3. п-Нитрофенилфосфат (27,6 ммоль/л).

Рабочий реагент готовят из реагентов № 1 и № 3, смешанных в пропорциях 4:1. Реагент стабилен не менее 10 дней при температуре 4°С в темноте или 3 месяца при температуре -20°С.

Ход работы. В 2 пробирки вносят реагент №2 в объеме 0,25 мл. Затем в опытную пробирку добавляют исследуемую среду (слезу) в объеме 0,025 мл. Содержимое пробирок перемешивают, инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут. В контрольную пробирку вносят 0,025 мл дистиллированной воды. Измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра PD-303 против воды при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см.

Расчет активности фермента проводят по калибровочной кривой.

Количественное определение у-глутамилтрансферазы (-ГТП) проводят унифицированным методом по «конечной точке» (Szasz G., J.P. Persijn, et.al. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1974, vol. 12, p.228.)

Принцип метода: содержащаяся в пробе -ГТП расщепляет L--глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид в глицилглицине до L--глутамилглицилглицина и 5-амино-2-нитробензоата. Количество образовавшегося в единицу времени 5-амино-2-нитробензоата пропорционально активности фермента в исходной пробе.

Реагенты: набор реактивов «-глутамилтрансфераза» фирмы «OLVEX DIAGNOSTICUM, SPb.» – Россия.

Реактив № 1. Буфер рН.

Реактив № 2. Раствор уксусной кислоты.

Реактив № 3. L--глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид.

Рабочий реагент готовят из реагентов № 1 и № 3, смешанных в пропорциях 4:1. Реагент стабилен 20 дней при температуре 2-8°С.

Процедура анализа. В 2 пробирки вносят реагент № 2 в объеме 0,25 мл. Затем в опытную пробирку добавляют исследуемую среду (слезу) в объеме 0,025 мл. Содержимое пробирок перемешивают, инкубируют при температуре 37°С в течение 15 минут. В контрольную пробирку вносят 0,025 мл дистиллированной воды. Измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра PD-303 против воды при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см.

Расчет активности фермента проводят по калибровочной кривой. При значении щелочной фосфатазы, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), -глутамилтранспептидазы, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), лейцинаминопептидазы 52,5 Ед/л диагностируют механическую желтуху.

Проведено обследование 19 доноров и 17 больных механической желтухой различной этиологии (доброкачественной, злокачественной). Из них 8 с механической желтухой, вызванной опухолями различной локализации, и 9 больных с механической желтухой, вызванной желчно-каменной болезнью с холедохолитиазом.

Активность ферментов биологических сред доноров
	ЩФ (нмоль/(с·л))	-ГТП (нмоль/(с·л))	ЛАП (Е/л)
Сыворотка крови	317,9±28,6	382,2±47,9	22,3±0,9
Слеза	153,1±21,7	245,2±42,5	4,7±0,5

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Донор П., муж., 38 лет. На момент обследования здоров. Активность в крови ЩФ составила 280 нмоль/(с·л), -ГТП – 250 нмоль/(с·л), ЛАП – 20,1 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 250 нмоль/(с·л), -ГТП – 180 нмоль/(с·л), ЛАП – 3,1 Е/л. Значения активности ферментов в пределах допустимых норм.

Пример 2. Больная Р., 50 лет. Диагноз: ЖКБ. Хронический калькулезный холецистит, холедохолитиаз. Механическая желтуха. При поступлении беспокоит боль в правом подреберье, тошнота. Кожные покровы, склеры иктеричны. По данным УЗИ – конкременты в желчном пузыре, холедох расширен до 16 мм, содержит камень диаметром до 10 мм; закл.: ЖКБ, холедохолитиаз, механическая желтуха. Биохимический анализ крови: билирубин общий – 180 мкмоль/л, билирубин прямой – 83,1 мкмоль/л, ЩФ – 11802 нмоль/(с·л), -ГТП – 5020 нмоль/(с·л), ЛАП – 156,7 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 400 нмоль/(с·л), -ГТП – 840 нмоль/(с·л), ЛАП – 94,2 Е/л. Значения активности ферментов значительно превышают нормальные показатели, как в крови так и в слезе.

Пример 3. Больной П., 60 лет. Диагноз: Опухоль головки поджелудочной железы. Механическая желтуха. При поступлении жалоб не предъявляет. Кожные покровы, склеры желтушные. По данным УЗИ – образование головки поджелудочной железы диаметром до 4 см, признаки механической желтухи; закл: Опухоль головки поджелудочной железы, механическая желтуха. Биохимический анализ крови: билирубин общий – 420 мкмоль/л, билирубин прямой – 178 мкмоль/л, ЩФ – 3680 нмоль/(с·л), -ГТП – 30240 нмоль/(с·л), ЛАП – 162,1 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 970 нмоль/(с·л), -ГТП – 1540 нмоль/(с·л), ЛАП – 86,5 Е/л.

Значения активности ферментов превышают нормальные показатели как в крови, так и в слезе.

Пример 4. Больная Д., 64 лет. Диагноз: ЖКБ. Хронический калькулезный холецистит. Поступила на плановое оперативное лечение. При поступлении жалоб нет. По данным УЗИ – конкременты в желчном пузыре, холедох не расширен, однородный; закл.: ЖКБ, хронический калькулезный холецистит. Биохимический анализ крови: билирубин общий – 9,8 мкмоль/л, ЩФ – 400 нмоль/(с·л), -ГТП – 1000 нмоль/(с·л), ЛАП – 20,1 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 70 нмоль/(с·л), -ГТП – 110 нмоль/(с·л), ЛАП – 4,6 Е/л. Значения активности ферментов в пределах допустимых норм.

Положительный эффект: забор слезы для исследования является неинвазивным методом, для способа характерны простота выполнения, доступность, скорость выполнения анализа.

Формула изобретения

Способ диагностики механической желтухи путем определения ферментов холестаза, отличающийся тем, что определяют ферменты холестаза в слезе и при значении щелочной фосфатазы, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), -глутамилтранспептидазы, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), лейцинаминопептидазы, равном и выше 52,5 Ед/л, диагностируют механическую желтуху.