Патент на изобретение №2331670
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ УСКОРЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (МСК) МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ИСКЛЮЧАЯ ЧЕЛОВЕКА, С НИЗКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТЬЮ И ВЫСОКОЙ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬЮ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии, медицине. Выделяют клетки-предшественники, затем их культивируют до получения целевой клеточной культуры. Культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей. Определяют количество апоптически и некротически поврежденных клеток, их морфологические характеристики. По экспрессии маркеров CD90, CD54, CD44, CD73, CD11b, CD45 определяют иммунофенотип клеток, и при снижении суммарного количества апоптически и некротически поврежденных клеток не менее чем в 2 раза по сравнению с репрезентативными культурами в условиях нормоксии, при полном сохранении имммунофенотипа МСК и при превышении числа быстроделящихся однотипных клеток над крупными медленно пролиферирующими клетками получаемую культуру считают культурой мезенхимальных клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью. Способ позволяет повысить пролиферативную активность культуры стромальных клеток-предшественников, снизить гетерогенность культуры. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей. С учетом возрастания области применения стволовых клеток перед цитологами достаточно остро стоит проблема получения в короткий временной период требуемого количества мезенхимальных стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, поскольку именно такие клетки необходимы для решения практических задач. Стромальные костномозговые клетки-предшественники, называемые также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), могут быть выделены из различных тканей. Они представляют собой малочисленную популяцию клеток, характеризующихся большим пролиферативным потенциалом, способных к самоподдержанию с сохранением недифференцированного состояния, а также обладающих возможностью дифференцироваться в различные клеточные типы под действием определенных стимулов [3, 4, 6, 12, 13]. Способность МСК дифференцироваться по крайней мере в клетки тканей мезенхимального происхождения лежит в основе их репаративного потенциала. Известен способ выращивания человеческих мезенхимальных стволовых клеток, взятых из крови, в котором одним из условий является повышенное количество CO2 (патент US 7060494 от 13.06.2006 г., класс 435/366, C12N 5/00). Гипоксия является ключевым звеном во многих патофизиологических процессах, а также в процессах тканевой репарации. Пониженное содержание кислорода может оказывать влияние на жизнеспособность МСК и их пролиферативный потенциал, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративных процессов в ткани. Известно, что гипоксия может увеличивать пролиферации ряда клеток предшественников [5, 8, 11]. Однако все проводимые эксперименты по изучению влияния гипоксии на стволовые клетки проводили в очень короткие временные интервалы, используя раличное содержание кислорода. Кратковременная экспозиция и различия в содержании кислорода не позволяют сделать определенные выводы о возможном использовании этого фактора для наращивания массы клеток, пригодной для регенеративных целей. Важными проблемами при культивировании клеток-предшественников является также их гетерогенность, различная степень коммитирования и процессы апоптоза и некроза in vitro, поскольку для практического применения используют стволовые клетки только с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью. Гетерогенность клеток проявлялась в наличии в культуре нескольких типов клеток, отличающихся по морфологии и пролиферативной активности, что описано рядом авторов [1, 2, 7, 10]. Так, в культурах МСК, по крайней мере, можно было выделить активно пролиферирующие клетки веретеновидной или треугольной формы с однородной цитоплазмой; активно пролиферирующие, более распластанные фибробластоподобные клетки с крупным ядром; медленно пролиферирующие, сильно распластанные, варьирующие по размеру клетки, имеющие полигональную, округлую или неправильную форму и неоднородную цитоплазму. Наиболее близким к заявленному способу является известный способ получения стволовых клеток по Javason (2001), в котором клетки культивировали в условиях нормального содержания кислорода (около 20%) и пересаживали при достижении субконфлуента. Стромальные клетки-предшественники, используемые в работе, выделяли из бедренных костей крыс. После ресуспендирования клетки переносили во флаконы для адгезии, через 2 суток удаляли флотирующие агрегаты, первичную культуру отмывали и добавляли свежую культуральную среду. В качестве среды для культивирования использовалась Однако получаемые при этом клетки обладали довольно высокой гетерогенностью, что делает их малопригодными для трансплантации. Кроме того, процесс получения достаточной массы клеток занимал значительное время – более 2-3 недель. Неожиданно нами было обнаружено, что культивирование стромальных клеток-предшественников костного мозга от 4 до 10 суток при использовании 1-2 пассажей в условиях гипоксии не только ускоряет пролиферацию клеток, но и приводит к снижению гетерогенности культуры, уменьшению количества апоптотических и некротических клеток при повышении ее пролиферативной активности и жизнеспособности клеток и при сохранении фенотипа и дифференцировочного потенциала, т.е. по сути нами была решена проблема ускоренного получения культур МСК с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью. Техническим результатом способа получения стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью является повышение пролиферативной активности культуры стромальных клеток-предшественников, ускорения тем самым процесса получения клеток, снижение гетерогенности культуры за счет преобладания быстроделящихся однотипных клеток над крупными медленно пролиферирующими клетками, уменьшения количества апоптотических и некротических клеток, при сохранении фенотипических характеристик по основным маркерам (кластерам дифференцировки). Технический результат достигался тем, что в известном способе ускоренного получения культур мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, включающем выделение клеток-предшественников и их последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры при том, что культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество апоптически и некротически поврежденных клеток, их морфологические характеристики, по экспрессии маркеров CD90, CD54, CD44, CD73, CD11b, CD45 определяют иммунофенотип клеток и при снижении суммарного количества апоптически и некротически поврежденных клеток не менее чем в 2 раза по сравнению с репрезентативными культурами в условиях нормоксии при полном сохранении имммунофенотипа МСК и при превышении числа быстроделящихся однотипных клеток над крупными медленно пролиферирующими клетками получаемую культуру считают культурой мезенхимальных клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью. В качестве клеток-предшественников использовали стромальные костномозговые клетки-предшественники. Морфологически однотипными клетками культур для МСК из костного мозга крыс считают клетки, имеющие размер 20-60 мкм. Морфологически однотипными клетками для МСК культур, выделенных из костного мозга человека, считают клетки, имеющие размер 10-20 мкм. Способ осуществляют следующим образом. Для осуществления способа выделяли стромальные клетки-предшественники костного мозга по Javason (2001). В работе использовали 1-2 пассажи культур МСК, выделенных из диафизов бедренных и больших берцовых костей молодых беспородных крыс по описанной ранее методике [10]. Стромальные клетки-предшественники, используемые в работе, выделяли из бедренных костей крыс. После ресуспендирования клетки переносили во флаконы для адгезии, через 2 суток удаляли флотирующие агрегаты, первичную культуру отмывали и добавляли свежую культуральную среду. В качестве среды для культивирования использовалась Для создания гипоксии в среде культивирования использовали герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада), в которую подавали газовую смесь (95% N2, 5% CO2) до установления в среде концентрации кислорода 5%. Содержание кислорода и давление в газовой среде контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков. Контрольные клетки находились в стандартных нормоксических условиях CO2 инкубатора с 5% CO2. Результаты осуществления способа В большинстве культур к четвертому пассажу наблюдался спад пролиферативной активности, характеризующийся доминированием медленно делящихся распластанных клеток. При дальнейшем субкультивировании это так называемое “пролиферативное торможение” сменялось подъемом и стабилизацией пролиферативной активности, что сопровождалось доминированием в культуре однородных по морфологии клеток. В работе использовались МСК на ранних пассажах (до второго), т.е. до момента, когда в культурах наблюдалось пролиферативное торможение. При оценке морфологических характеристик МСК, культивируемых в разных условиях, было показано, что гипоксия стимулировала образование островков из небольших по размеру клеток с однородной по оптической плотности цитоплазмой. Количество и размер таких островков были больше в гипоксических культурах (чертеж). В условиях гипоксии также снижалась доля варьирующих по размеру и разнородных по морфологическим особенностям крупных (60-200 мкм), распластанных, медленно делящихся клеток. Таким образом, гипоксия снижала степень гетерогенности культур МСК, увеличивая долю однотипных, небольших по размеру клеток (20-60 мкм). Можно предположить, что более низкая пролиферативная активность крупных распластанных клеток в культуре отражали степень их повреждения в условиях окислительного стресса при культивировании клеток в нормоксии (21% О2). Снижение концентрации кислорода обуславливало уменьшение интенсивности окислительного стресса, вероятно, влияющего на долю крупных распластанных клеток, также называемых некоторыми авторами “зрелыми” МСК [10] в культуре. Торможение пролиферации и морфологические особенности этих клеток, возможно, отражают степень их повреждения в условиях окислительного стресса. Пролиферативная активность МСК оценивалась по увеличению количества клеток в рандомически выбранных полях зрения после четырех суток культивирования МСК на 1-2 пассажах. Было показано, что гипоксия статистически достоверно стимулировала пролиферативную активность клеток-предшественников, что согласуется с данными других исследователей [5, 8, 11]. При культивировании клеток в условиях гипоксии их число увеличилось в среднем в 7 раз, в то время как в нормоксических условиях количество клеток возросло в среднем лишь в 2,1 раза. Следует отметить, однако, что прирост количества клеток в нормоксических культурах варьировал, отражая, вероятно, индивидуальные особенности животных, из костного мозга которых были выделены клетки; особенности определенных этапов культивирования; а также неспецифичность метода выделения МСК, не позволяющего получение при каждом выделении стандартной по ряду характеристик популяции клеток. Механизм активации пролиферации МСК при гипоксии связан, вероятно, с индукцией некоторых киназных каскадов, таких как SAP-киназные сигнальные пути (JNK и р38), активируемых обычно в ответ на стрессовые факторы и приводящих к стимуляции пролиферативной активности клеток [14]. Оценка жизнеспособности клеток при их культивировании в нормо- и гипоксических условиях показала, что процент как апоптотических, так и некротических клеток был примерно в два раза ниже в гипоксических культурах по сравнению с нормоксическими (Таблица 1), т.е. стимулирующий эффект гипоксии на пролиферацию клеток-предшественников на ранних этапах культивирования сопровождался отсутствием ее повреждающего действия на клетки. Следует отметить, что естественной средой для стромальных клеток-предшественников in vivo является костный мозг, где содержание кислорода не превышает 5%, что может быть связано с цитопротекторной ролью гипоксии на ранних этапах культивирования, до появления устойчивой к новым условиям стабильно пролиферирующей популяции клеток. С другой стороны, есть данные, что в некоторых случаях гипоксия может опосредовать образование ряда антиапоптотических белков [9]. Проведение иммунофенотипической характеристики культур, находившихся в нормо- и гипоксических условиях, показало, что гипоксия не изменяет значительно экспрессию поверхностных маркеров, характерных для МСК, но снижает и без того небольшое количество клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры, стимулируя образование более гомогенной по иммунофенотипическим показателям популяции клеток-предшественников (Таблица 2). Таким образом, культивирование клеток в условиях 5% O2 оказывало стимулирующий эффект на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования, что выражалось в изменении соотношения морфологических типов клеток в культуре; стимуляции пролиферативной активности клеток; отсутствии повреждающего и/или наличии протективного воздействия на клетки; снижении доли клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры.
Источники информации 15. Патент US 7060494 от 13.06.2006 г., класс 435/366, C12N 5/00.
Формула изобретения
1. Способ ускоренного получения культур мезенхимальных стволовых клеток (МСК) млекопитающихся, исключая человека, с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, включающий выделение клеток-предшественников и их последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, отличающийся тем, что культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество апоптически и некротически поврежденных клеток, их морфологические характеристики, по экспрессии маркеров CD90, CD54, CD44, CD73, CD11b, CD45 определяют иммунофенотип клеток, и при снижении суммарного количества апоптически и некротически поврежденных клеток не менее чем в 2 раза по сравнению с репрезентативными культурами в условиях нормоксии, при полном сохранении имммунофенотипа МСК и при превышении числа быстроделящихся однотипных клеток над крупными медленно пролиферирующими клетками получаемую культуру считают культурой мезенхимальных клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью. 2. Способ по п.1 отличающийся тем, что в качестве клеток-предшественников используют стромальные костно-мозговые клетки-предшественники. 3. Способ по п.1 отличающийся тем, что морфологически однотипными клетками культур для МСК из костного мозга крыс считают клетки, имеющие размер 20-60 мкм. 4. Способ по п.1 отличающийся тем, что морфологически однотипными клетками для МСК культур, выделенных из костного мозга человека, считают клетки, имеющие размер 10-20 мкм.
РИСУНКИ
RH4A – Выдача дубликата патента Российской Федерации на изобретение
Дата выдачи дубликата: 30.01.2009
Наименование лица, которому выдан дубликат:
Извещение опубликовано: 20.03.2009 БИ: 08/2009
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-МЕМ (ICN, США или “Биолот”, Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), пирувата натрия (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 8-10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США). При достижении культурой 70-90% монослоя проводили пассирование клеток. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 4 дня, субкультивирование продолжали на высоких пассажах. Морфологические характеристики МСК оценивали визуально с помощью фазовоконтрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия), сопряженной с ним камеры и специального программного обеспечения (Sigma Scan Pro5). Оценка пролиферативной активности культур МСК проводилась путем подсчета числа клеток в случайно выбранных фиксированных полях зрения до и после инкубации. Иммунофенотипическая характеристика МСК проводилась с помощью метода проточной цитофлуориметрии (цитофлуориметр Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител (BD Bioscience, США) к маркерам МСК. Использовались антитела как к позитивным маркерам (CD90, CD44, CD54, CD106, CD73), так и к негативным маркерам (CD45, CD11b, CD62L). Необходимое количество клеток (1·105-5·105) после трипсинизации и отмывки отбирали для окрашивания антителами в рекомендуемой концентрации в 100 мкл фосфатного буфера при 4°С в течение 30 минут. Оценка жизнеспособности МСК проводилась также цитофлуориметрически с использованием набора Annexin V FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.