Патент на изобретение №2330860

(54) ЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ С КОРТИКОТРОПИНПОДОБНОЙ СТРУКТУРОЙ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИСТРЕССОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биохимии, конкретнее к биологически активным пептидам, обладающим стресспротекторной активностью, которые могут найти применение в медицине и фармакологии. Изобретение решает задачу расширения ряда безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу за счет циклопептидов I и II, имеющих следующую аминокислотную последовательность: Cyclo(Gly¹-Lys²-Val³-Leu⁴-Lys⁵-Lys⁶-Arg⁷-Arg⁸)n, где n=2-3. 5 табл.

Изобретение относится к биохимии, конкретнее к биологически активным пептидам, обладающим стресспротекторной активностью, которые могут найти применение в медицине и фармакологии.

Спокойная жизнедеятельность – это только одна из форм существования живой системы. Жизнь современного человека полна неожиданностей, экстремальных событий, выходящих далеко за границы нормы реакции. Напряженная жизнедеятельность, или стресс, – столь же необходимая и постоянно встречающаяся форма существования, как и жизнедеятельность спокойная. Неизбежность стрессов обусловлена появлением в среде обитания новых, необычных или исчезновением старых необходимых раздражителей, колебаниями силы и длительности действия знакомых агентов, природными и антропогенными изменениями в биосфере. На самом деле, периодические стрессы, предпочтительно умеренные по силе и продолжительности, необходимы организму, потому что тренируют нервную, иммунную, эндокринную, а также дыхательную, сердечно-сосудистую, пищеварительную и выделительную системы, стимулируют их активность, поддерживают в оптимальном рабочем состоянии. Все стресс-агенты, при всем их разнообразии, вызывают стереотипную неспецифическую ответную реакцию, разумеется, с рядом отличий, обусловленными различиями стрессоров. Биологический смысл и назначение стресса – повысить общую сопротивляемость, неспецифическую устойчивость живой системы по отношению к действующему стимулу и другим стрессорам.

Однако когда организм ослаблен или стрессорное воздействие оказывается чрезвычайно сильным, возникает необходимость поступления этих веществ извне. Поэтому разработка новых эффективных и безопасных средств, способных повышать устойчивость организма к стрессу, – это важная и актуальная задача современной биохимии и фармакологии.

В настоящее время биологически активные пептиды, производные природных пептидных гормонов, рассматривают как потенциальные лекарственные средства нового класса. Такие качества пептидов, как быстрая реакция организма на их введение, практически полное отсутствие токсичности, а также тот факт, что продуктами деградации пептидов являются аминокислоты, все больше привлекают внимание фармакологов и клиницистов. Полифункциональность пептидных гормонов является лимитирующим фактором их применения в качестве лекарственных препаратов. Поэтому основной задачей при конструировании новых лекарственных средств на базе природных пептидов является синтез селективно действующих аналогов с узким спектром действия, устойчивых к ферментативному расщеплению.

Известен адаптоген стресс-корректор, пептид Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly. Фармацевтическая композиция на основе смеси диметилсульфоксида и полиэтиленоксида-400 (или диметилсульфоксида и оливкового масла), содержащая от 1 до 1000 мкг синтетического пептида на 1 кг массы животного, эффективно защищает животных от воздействия физических, эмоциональных и химических факторов внешней среды (патент РФ №2155064, МПК А61К 38/08, опубл. 2000).

Известен пептид дельта сна (DSIP), нонапептид с последовательностью аминокислот Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu, обладающий антистрессовым, стресс-протекторным, ноотропным и антинаркотическим действием. При соотношении компонентов в композиции: на 1 мг DSIP-реаферона 1·10³-10⁴ ME, обеспечивает антивирусное действие на организм с одновременным антистрессовым эффектом, повышает иммунитет (патент РФ №2211703, МПК А61К 38/08, опубл. 2003). При дополнительном введении в композицию глицина, карнозина, мелатонина препарат обладает свойствами увеличивать иммунитет организма, активизировать мозговые процессы, способствовать профилактике и лечению психоэмоциональных нарушений, вирусных заболеваний.

Известен нейропептид Y, осуществляющий поддержание или потенциирование эндогенных неврологических и нейропсихологических эффектов систем нейропептида Y головного мозга (NPY) введением ингибиторов дипептидилпептидазы IV (DP IV) и DP IV-подобных ферментов. С его помощью можно лечить гипертензию, лихорадочное состояние, расстройства сна, анорексии, связанные с тревожностью нарушений, в том числе депрессии, припадков, в том числе эпилепсии, синдрома отмены лекарственного средства и алкоголизма, нейродегенеративных нарушений, в том числе нарушения когнитивной функции и деменции, и психоневрологических нарушений, в том числе шизофрении, через потенциирование опосредованных рецептором Yl NPY эффектов в центральной нервной системе (ЦНС) (патент РФ №2286149, МПК 31/40, опубл. 2006).

Недостатками вышеперечисленных препаратов являются их сложная композиция, в данном сочетании они могут вызывать аллергии. Перечисленные пептиды не решают задачу безопасного, эндогенного препарата, нормализующего в целом систему гипоталамус-гипофиз-надпочечники, приводящем в норму показатели за счет естественных механизмов регуляции ответа на стресс. Препараты нельзя принимать как в бытовых условиях, так и при госпитализации без необходимости длительного лечения и без побочных эффектов. Препараты вызывают притупление внимания, снижение уровня активности, сонливость и миорелаксацию.

Известен наиболее близкий к заявленному фрагмент 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека (GK-VLKKRR), более чем на 80% подобный фрагменту кортикотропина 10-18 (GKPVGKKRR). Октапептид GKVLKKRR (авторское название – лейкоккортикотропин) с высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором кортикотропина на спленоцитах и макрофагах мыши (Zav’yalov VP, Maiorov VA, Safonova NG, et al. Receptor-binding properties of the peptides corresponding to the ACTH-like sequence of human pro-interleukin-1_d, 2,2±0,1 нМ). В диапазоне концентраций 1-1000 нМ пептид не влияет на активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы. При троекратном интраназальном введении в дозах 10-20 мкг/животное лейкокортикотропин практически не изменяет уровень 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс в отсутствие термического воздействия. В то же время, при холодовом или тепловом шоке пептид отменяет (доза 20 мкг/животное троекратно) или значительно уменьшает (доза 10 мкг/животное троекратно) резкое возрастание содержания КС в надпочечниках, вызванное шоком. Таким образом, лейкокортикотропин способен нормализовать уровень КС в коре надпочечников крысы при стрессе. К недостаткам известного соединения относится недостаточно высокая стресспротекторная активность пептида.

Для лечения состояния стресса наибольший интерес представляет первоначальная реакция на стресс-фактор – фаза тревоги или мобилизации. Истинно стрессорные (неспецифические) реакции преобладают лишь на стадии тревоги. Многообразие процессов, происходящих на первой стадии общего адаптационного синдрома позволило выделить 4 фазы этого процесса: 1 – катаболическая (возбуждение рецепторов адренергических и дофаминергических структур, щитовидной железы, выделение липотропина, глюкагона), 2 – переходная (блокада вышеуказанных рецепторов и уменьшение выделения гормонов щитовидной железы, липотропина и глюкагона), 3 – анаболическая (возбуждение рецепторов холинергических, серотонинергических и других структур, выделение адренокортикотропного гормона (АКТГ), инсулина, эндорфинов, энкефалинов), 4 – эффекторная (восстановление гомеостаза, синтез белков, иммунные реакции, адаптация, тренированность или патология). Регулирование этих процессов с помощью циклопептидов I и II приводит в последующем к повышению резистентности организма к стресс-фактору и функционированию органов и систем на должном для этой ситуации уровне. Наряду с этим происходят репарационные процессы, направленные на восстановление повреждений, вызванных действием стресса.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу.

Поставленная задача решается за счет пептида, имеющего следующую аминокислотную последовательность:

cyclo(Gly¹-Lys²-Val³-Leu⁴-Lys⁵-Lys⁶-Arg⁷-Arg⁸)_n,

где n=2-3.

Заявляемые циклопептиды I (n=2) и II (n=3) способны нормализовать содержание 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия. Троекратное интраназальное введение циклопептидов I и II крысам в дозах 10-20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до холодового или теплового шока предотвращает резкое возрастание уровня 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме, а также устраняет изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде, вызванные температурным воздействием.

Таким образом, техническим результатом предполагаемого изобретения является высокая стресс-протекторная активность пептидов, сочетаемая с узконаправленным действием, что позволяет рассматривать их в качестве основы для создания безопасных лекарственных средств повышающих устойчивость организма к различным стрессовым воздействиям (холодовому, тепловому, гипоксии, геморрагии).

Циклопептиды I и II состоят из 16 и 24 аминокислотных остатков соответственно, т.е. являются сравнительно небольшими молекулами, что упрощает их получение химическим синтезом. Кроме того, циклическая форма пептидов продлевает время жизни пептидов в активной среде, т.к. делает их более устойчивыми к действию протеаз. Это позволяет увеличить время действия и усилить эффект действия пептидов.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Химический синтез линейного прототипа – лейкокортикотропина.

Лейкокортикотропин (GKVLKKRR) получают методом твердофазного синтеза с последовательным наращиванием пептидной цепи. Защищенный пептид получают по методике in situ соответствующих амино-ацил полимерах с емкостью 0,7 ммоль/г, используя синтезатор Applied Biosystems 430 A. В качестве постоянных защитных групп используют мезитилен-2-сульфонильную (для аргинина) и 2-хлорбензилокси-карбонильную (для лизина). Трет-бутилоксикарбонильную группировку используют в качестве временной защиты альфа аминогрупп. Удаление боковых защитных группировок и отщепление пептида от полимера проводят под действием безводного фтористого водорода в присутствии м-крезола.

Лейкокортикотропин очищают с помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии (хроматограф Gilson, Франция, колонка Prep.Nova-Pak HR С 18,49×300 мм, зернистость 6 мкм) и характеризуют данными аналитической ОФ ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция, колонка DeltaPak С 18 100 Å, 3.9×150 мм, 5 мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 20-50%), аминокислотного анализа (гидролиз 6N HCl, 24 часа, 110°С; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Voyager-DE BioSpectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США). Аминокислотный состав лейкокортикотропина соответствует теоретическому. Основные характеристики пептида приведены в таблице 1.

Для определения аминокислотного состава пептида используют аминокислотный анализатор 4151 Alpha Plus Biochrom (LKB, Швеция) и интегратор 2220 Recording Integrator Bromma (LKB, Швеция).

Для приготовления гидролизата взвешивают 1 мг исследуемого образца пептида, помещают его в специальную ампулу, прибавляют 1 мл 6N HCl и запаивают. Ампулу выдерживают в термостате при 110°С в течение 22 часов. Затем ампулу вскрывают, содержимое переносят в круглодонную колбу и упаривают на роторном испарителе. Остаток растворяют в 0,5 мл стартового буфера, рН 2,2. Объем запускаемого образца составляет 10-50 мл. Аминокислотный состав рассчитывают при сравнении хроматограмм образца и стандартной калибровочной смеси аминокислот.

Структуру очищенного вещества подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Voyager-DE BioSpectrometry Workstation (Per Sepetive Biosystems, США) с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют -циано-4-гидроксикоричную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов с диапазоном 700-3500 Да (Bruker Daltonik, Германия).

Пример 2. Химический синтез циклического аналога лейкокортикотропина.

Посадку первой аминокислоты на оксим-полимер осуществляют методом симметричных ангидридов, используя 2-кратный избыток симметричного ангидрида Вос-Gly-OH, а в качестве катализатора 0,1 эквивалента диметиламинопиридина. Реакцию проводят в смеси диметилформамида и N-метилпирролидона в соотношении 1:1 в течение 20 часов.

Аминокислотные остатки присоединяют к пептидил-полимеру методом оксибензотриазоловых эфиров, используя 5-кратные избытки соответствующих производных аминокислот. Для активации 1 экв. аминокислоты используют 1 экв. гидроксибензотриазола и 1 экв. диизопропилкарбодиимида. Активацию проводят при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакции проводят в диметилформамиде в течение 30 минут. Объем реакционной смеси составляет 15 мл на 1 г сухого полимера. Содержание непрореагировавших аминогрупп контролируют визуально при помощи качественного нингидринового теста.

Циклизацию пептида проводят обработкой раствором уксусной кислоты (10 экв.) в диметилформамиде в присутствии диизопропилэтиламина (4 экв.) в течение 20 часов. Деблокирование боковых защитных групп осуществляют безводным жидким фтористым водородом в присутствии скавенджеров. Для этого после упаривания диметилформамида на роторном испарителе защищенный циклический пептид растворяют в хлористом метилене и переносят в сосуд для работы с жидким фтористым водородом. Хлористый метилен упаривают на водоструйном насосе, остаток обрабатывают безводным жидким фтористым водородом в присутствии мета-крезола при 0°С в течение 30 минут. Фтористый водород упаривают в вакууме водоструйного насоса, продукт растворяют в трифторуксусной кислоте и затем высаживают из диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают в эксикаторе до постоянного веса.

С помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии (хроматограф Gilson, Франция, колонка Prep. Nova-Pak HR С 18, 49×300 мм, 6 мкм) выделено два мажорных продукта синтеза. Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% (v/v) в 0,1% трифторуксусной кислоте в течение 30 минут со скоростью элюции 5 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 220 нм. Оба пептида характеризуют данными аналитической ОФ ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция, колонка Luna Phenomenex С 18 (2) 100Å, 4,6×150 мм, 5 мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 5-35%), аминокислотного анализа (гидролиз 6N HCl, 24 часа, 110°С; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Voyager-DE BioSpectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США) (все анализы проводят, как описано в примере 1). Содержание примесей в синтетических препаратах не превышает 4%. Данные приведены в таблице 1.

Анализ полученных экспериментальных данных показывает, что первый пептид с молекулярной массой 967,42 является циклическим мономером лейкокортикотропина, а второй пептид с массой 1933,29 его циклическим димером. Циклический димер получен с наибольшим выходом (20%), что, по-видимому, связано с тем, что данный цикл является наименее напряженным.

Пример 3. Химический синтез циклопептида II.

Все первоначальные стадии проводят, как описано выше (см. пример 2). В дополнительном эксперименте оставшийся после стадии циклизации полимер промывают хлористым метиленом, высушивают до постоянного веса и обрабатывают безводным жидким фтористым водородом в условиях, аналогичных вышеописанным. Полученный продукт очищают до гомогенного состояния и характеризуют по вышеописанным методикам (пример 1). Анализ полученных характеристик показывает, что это соединение является циклическим тримером лейкокортикотропина. Измеренная моноизотопная молекулярная масса циклического триммера составляет 2901,30.

Пример 4.

Определение влияния циклопептидов I и II и их прототипа – фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека на уровень кортикостероидов и катехоламинов в крови и надпочечниках на моделях острой геморрагии и гипобарической гипоксии у крыс in vivo.

В экспериментах используют половозрелых самцов крыс линии Wistar массой 180-200 г. Моделью острой геморрагии служит 1-часовая артериальная гипотензия. Для ее создания у наркотизированных крыс (нембутал 40 мг/кг) через катетер в хвостовой артерии производят взятие крови до достижения среднего артериального давления 40 мм ртутного столба. До начала кровопотери животным внутривенно вводят гепарин (0,5 мл, 50 ЕД/мл) для предотвращения свертывания крови во время проведения длительного эксперимента. По истечении времени гипотензии крыс реанимируют путем внутриартериального введения взятой крови. Сразу после восполнения кровопотери проводят внутривенную инфузию исследуемого пептида (1 и 10 мкг/кг/мин в течение 10 мин) или аналогичного объема (0,8 мл) физиологического раствора через яремную вену. Поскольку, как правило, регуляторные пептиды имеют каскадный механизм действия, и их влияние может сказываться через длительное время после введения, декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводят на 1-е и 7-е сутки. Контрольной группе животных проводится полная операция без геморрагического шока. Значения биохимических показателей в этой группе принимают за 100%. Контрольные и опытная группы содержат по 10 крыс.

Для создания условий развития острой гипобарической гипоксии крыс помещают в барокамеру с давлением 154 мм ртутного столба, соответствующим атмосферному давлению на высоте 11500 м от уровня моря, и выдерживают в этих условиях до принятия ими бокового положения. Исследуемые пептиды крысам опытной группы вводят интраназально (0,1 и 1 мкг/кг массы тела животного) за 1 и 24 часа до “подъема”, параллельно крысам контрольной группы вводят физиологический раствор. Декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводят на 1-е и 7-е сутки после “подъема”. Значения биохимических показателей в контрольной группе принимают за 100%. Каждая группа содержит по 10 животных.

, (длине волны) 530 нм ( возбуждающего света = 470 нм). Количество 11-оксикортикостероидов определяют по калибровочной кривой и выражают в микрограммах на 1 г ткани. Для статистической обработки результатов используют t-критерий Стьюдента.

=500 нм и возбуждающем свете с =410 нм и для норадреналина при =485 и =385 нм соответственно. Количество адреналина и норадреналина определяют по калибровочной кривой и выражают в микрограммах на 1 г ткани. Достоверность различий экспериментальных данных между контролем и опытом оценивают по t-критерию Стьюдента.

Данные о влиянии циклопептидов I и II и их прототипа на содержание 11-оксикортикостероидов (ЛС) и катехоламинов (адреналина и норадреналина) в надпочечниках и плазме крови крыс на 1-е и 7-е сутки постреанимационного периода после геморрагического шока приведены в таблице 2. Видно, что через 1 сутки после шока уровень КС в надпочечниках и плазме возрастает на 61 и 52% соответственно. Через 7 суток содержание КС в надпочечниках и плазме снижается, оставаясь выше контрольного уровня на 20% и 33%, соответственно. Введение пептида-прототипа в дозе 1 мкг/кг приводит к уменьшению содержания КС в надпочечниках и плазме как через 1, так и через 7 суток, увеличение дозы до 10 мкг/кг сопровождается дальнейшим снижением уровня гормонов. Циклопептиды I и II проявляют значительно большую активность: введение любого из них в дозе 10 мкг/кг нормализует содержание КС в надпочечниках и плазме. Данные табл.2 показывают, что через 1 сутки после шока концентрация адреналина и норадреналина в надпочечниках снижается по сравнению с контрольным уровнем на 35% и 26% соответственно, а через 7 суток эти показатели близки к контрольным значениям. Напротив, через 1 час после шока содержание адреналина в плазме возрастает на 86%, а через 7 суток превышает контрольный уровень на 29%. Резкое снижение содержания адреналина в надпочечниках через 1 час после шока и одновременный рост его в плазме свидетельствует об увеличении секреции гормона из надпочечников в кровь. Ведение пептида-прототипа в дозах 1 и 10 мкг/кг уменьшает данный эффект: содержание адреналина через 1 и 7 суток после шока в железе возрастает, а в плазме снижается. Циклопептиды I и II характеризуются большей активностью: в дозе 1 мкг/кг любой из них приводит содержание адреналина в надпочечниках и плазме к контрольному уровню. Таким образом, циклопептиды I и II в дозах 1 и 10 мкг/кг устраняют резкие изменения уровней КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс, вызываемые геморрагическим шоком. Активность пептидов убывает в ряду: циклопептид II > циклопептид I >> пептид-прототип.

В табл.3 приведены результаты исследования влияния циклопептидов I и II и пептида-прототипа на содержание КС и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс на 1-е и 7-е сутки после гипобарической гипоксии. Видно, что характер изменений содержания гормонов в надпочечниках и плазме после “подъема” такой же, как и в случае геморрагического шока. Введение пептида-прототипа в дозах 0,1 и 1 мкг/кг за 1 и 24 часа до “подъема” корригирует, а циклопептидов I и II нормализует содержание КС и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс, подвергнутых гипоксии.

Циклопептиды I и II способны нормализовать содержание 11-оксикортико-стероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия.

Пример 5.

Определение влияния циклопептидов I и II и их прототипа – фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека на уровень кортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и содержание свободного гистамина и активности диаминоксидазы в сердечной мышце на моделях холодового и теплового шока у крыс in vivo.

Для создания модели холодового шока крыс выдерживают в состоянии свободного плавания в кювете с водой при температуре 4°С в течение 3 минут. Для теплового воздействия животных помещают в вентилируемую термокамеру при температуре 40°С на 1 час. Растворы исследуемых пептидов (10 и 20 мкг/животное) или физиологический раствор вводят интраназально три раза за 3, 2 и 1 сутки до шока. Контрольная группа животных не подвергается термическому воздействию. Значения биохимических показателей в этой группе принимают за 100%.

Содержание глюкокортикоидов (11-оксикортикостероидов, КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс определяют, как описано выше.

=450 нм и возбуждающем свете с =365 нм. Количество гистамина определяют по калибровочной кривой и выражают в микрограммах на 1 г ткани. Активность ДАО оценивают по убыванию субстрата (гистамина) и выражают в мкг гистамина за 1 час в 1 г ткани. При статистической обработке результатов достоверность различий между опытом и контролем оценивают по t-критерию Стьюдента.

В табл.4 представлены данные о влиянии циклопептидов I и II и пептида-прототипа на содержание (КС) и катехоламинов (адреналина и норадреналина) в надпочечниках и плазме крови крыс после холодового и теплового шока. Видно, что как холодовое, так и тепловое воздействие приводит к значительному увеличению (в 2,5-3 раза) содержания КС и адреналина в надпочечниках и плазме. Пептид-прототип (дозы 10 и 20 мкг/животное троекратно) оказывает значительное корригирующее действие на уровень КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме. Циклопептиды I и II проявляют большую активность: в дозе 20 мкг/животное троекратно они отменяют резкое возрастание содержания КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме, вызванное температурным воздействием.

В табл.5 приведены данные о влиянии циклопептидов I и II и пептида-прототипа на активность диаминоксидазы (ДАО) и содержание свободного гистамина в миокарде крыс после холодового и теплового шока. Видно, что у крыс, подвергнутых холодовому шоку, активность фермента резко снижается (до 37% от контрольного уровня), а тепловому, напротив, значительно возрастает (на 60%). В то же время, содержание свободного гистамина незначительно возрастает как при холодовом, так и при тепловом шоке (на 10 и 22% соответственно). Введение циклопептидов I и II крысам в дозах 10 и 20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до шока предотвращает резкие изменения активности ДАО и нормализует содержание свободного гистамина в сердечной мышце. Пептид-прототип проявляет значительно меньшую антистрессорную активность.

Троекратное интраназальное введение циклопептидов I и II крысам в дозах 10-20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до холодового или теплового шока предотвращает резкое возрастание уровня 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме, а также устраняет изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде, вызванные температурным воздействием.

Таблица 2. Влияние циклопептидов I и II и их прототипа – фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс в постреанимационном периоде после геморрагического шока.
Гормон	Группа животных	Уровень гормона (%)
		Через 1 сутки	Через 7 суток
КС в надпочечниках	Контроль	100±8*	100±8*
		(33±3 мкг/г)	(36±3 мкг/г)
	ГШ + ФР***	161±13*	120±8*
	ГШ + прототип (1 мкг/кг)	139±11*	116±8*
	ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)	127±10*	107±9*
	ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)	119±11*	105±8*
	ГШ + прототип (10 мкг/кг)	128±10*	106±11*
	ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг) ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)	104±11* 102±12*	98±10* 99±9*
КС в плазме	Контроль	100±9*	100±9*
		(0,39±0,04 мкг/мл)	(0,30±0,03 мкг/мл)
	ГШ + ФР***	152±8*	133±11*
	ГШ + прототип (1 мкг/кг)	142±8*	122±9*
	ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)	129±9*	111±8*
	ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)	117±9*	109±9*
	ГШ + прототип (10 мкг/кг)	118±7**	112±8*
	ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг) ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)	100±8* 102±10*	104±8* 97±9*
Адреналин в надпочечниках	Контроль	100±13*	100±15*
		(431±56 мкг/г)	(448±67 мкг/г)
	ГШ + ФР***	65±9*	118±12*
	ГШ + прототип (1 мкг/кг)	72±7**	112±9*
	ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)	89±8*	103±9*
	ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)	97±9*	100±9*
	ГШ + прототип (10 мкг/кг)	86±7**	107±10*
	ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг) ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)	100±10* 100±8*	99±9* 100±9*
Адреналин в плазме	Контроль	100±10*	100±15*
		(40,8±4,1 мкг/мл)	(28,5±4,3 мкг/мл)
	ГШ + ФР***	186±11*	129±12*
	ГШ + прототип (1 мкг/кг)	165±10*	118±11*
	ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)	108±9*	108±10*
	ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)	106±10*	104±11*
	ГШ + прототип (10 мкг/кг)	139±6**	110±9*
	ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг) ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)	105±8* 98±9*	100±9* 97±10*
Норадреналин в надпочечниках	Контроль	100±10*	100±13*
		(210±21 мкг/г)	(196±26 мкг/г)
	ГШ + ФР***	74±8*	109±12*
	ГШ + прототип (1 мкг/кг)	88±10*	107±10*
	ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)	98±9*	98±10*
	ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)	100±10*	99±10*
	ГШ + прототип (10 мкг/кг)	92±6**	105±7**
	ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг) ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)	100±9* 99±10*	99±9* 98±9*
*Р<0.02, **Р<0.001 ***Геморрагический шок + физиологический раствор

Таблица 3. Влияние циклопептидов I и II и их прототипа – фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс после гипобарической гипоксии.
Гормон	Группа животных	Уровень гормона (%)
		Через 1 сутки	Через 7 суток
КС в надпочечниках	Контроль	100±12*	100±10*
		(34±4 мкг/г)	(36±4 мкг/г)
	ГГ + ФР***	168±12*	118±10*
	ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)	142±12*	115±10*
	ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)	121±10*	100±11*
	ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)	115±11*	102±12*
	ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)	123±8*	108±9*
	ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды) ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)	99±11* 100±12*	100±11* 97±10*
КС в плазме	Контроль	100±9*	100+10*
		(0,33±0,03 мкг/мл)	(0,35±0,04 мкг/мл)
	ГГ + ФР***	144±9*	133±10*
	ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)	130±10*	125±7*
	ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)	109±10*	107±10*
	ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)	103±12*	100±9*
	ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)	118±7**	110±8*
	ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды) ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)	102±10* 98±9*	100±10* 103±12*
Адреналин в надпочечниках	Контроль	100±13*	100±12*
		(412±54 мкг/г)	(422±51 мкг/г)
	ГГ + ФР***	82±10*	109±12*
	ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)	90±6**	102±12*
	ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)	95±10*	100±10*
	ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)	98±10*	104±10*
	ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)	94±7**	106±13*
	ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды) ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)	101±11* 100±10*	100±12* 100±10*
Адреналин в плазме	Контроль	100±12*	100±11*
		(32,4±3,9 мкг/мл)	(29,2±3,2 мкг/мл)
	ГТ + ФР***	166±12*	118±12*
	ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)	136±11*	110±10*
	ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)	119±10*	100±10*
	ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)	112±11*	104±12*
	ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)	117±6**	106±9*
	ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды) ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)	102±10* 97±10*	102±10* 99±11*
*Р<0.02, **Р<0.001 ***Гипобарическая гипоксия + Физиологический раствор

Таблица 4
Влияние циклопептидов I и II и их прототипа – фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс после холодового и теплового шока.
Гормон	Группа животных	Уровень гормона (%)
КС в надпочечниках	Контроль	100±12*
		(37±4 мкг/г)
	ХШ + ФР**	259±21*
	ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	166+15*
	ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	139±13*
	ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	111±12*
	ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	100±10*
	ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	106+11*
	ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	98±12*
	ТШ + ФР***	304±27*
	ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	173±12*
	ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	133±11*
	ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	124±12*
	ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	106±11*
	ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды) ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	119±12* 103±11*
КС в плазме	Контроль	100±10*
		(0,39±0,04 мкг/мл)
	ХШ + ФР**	212±25*
	ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	152±10*
	ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	130±11*
	ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	118±12*
	ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	109±12*
	ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	115±10*
	ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	104±11*
	ТШ + ФР***	276±33*
	ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	160±17*
	ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	133±15*
	ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	108±10*
	ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	96±11*
	ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды) ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	100±10* 99±11*
Адреналин в надпочечниках	Контроль	100±15*
		(408±61 мкг/г)
	ХШ + ФР**	298±28*
	ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	169±14*
	ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	131±12*
	ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	119±12*
	ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	111±10*
	ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	115±13*
	ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	94±10*
	ТШ + ФР***	335±34*
	ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	176±18*
	ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	145±13*
	ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	126±14*
	ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	104±11*
	ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды) ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	116±14* 95±13*
Адреналин в плазме	Контроль	100±10*
		(32,2±3,2 мкг/мл)
	ХШ + ФР**	255±23*
	ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	150±10*
	ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	114±12*
	ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	100±11*
	ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	102±13*
	ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	112±10*
	ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	97±9*
	ТШ + ФР***	304±30*
	ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	142±16*
	ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	125±12*
	ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	108±10*
	ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	103±9*
	ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды) ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	104±12* 98±10*
Норадреналин в надпочечниках	Контроль	100±10*
		(224±22 мкг/г))
	ХШ + ФР**	174±21*
	ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	135±12*
	ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	118±11*
	ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	100±10*
	ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	94±12*
	ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	105±10*
	ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	97±10*
	ТШ + ФР***	238±28*
	ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	153±14*
	ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	120±10*
	ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	103±11*
	ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	100±10*
	ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды) ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	100±13* 104±14*
*Р<0.02 **Холодовой шок + физиологический раствор ***Тепловой шок + физиологический раствор

Таблица 5 Влияние циклопептидов I и II и их прототипа – фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1 человека на активность диаминоксидазы (ДАО) и содержание свободного гистамина в миокарде крыс после холодового и теплового шока.
Группа животных	Активность ДАО (%)	Содержание свободного гистамина(%)
Контроль	100±14*	100±12*
	(37,2±5,3 мкг гистамина/г ткани/час)	(3,5±0,4 мкг/г ткани)
ХШ + ФР**	37±6*	110±9*
ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	62±12*	108±11*
ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	79±10*	102±12*
ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	90±12*	102±11*
ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	89±12*	98±12*
ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	94±11*	100±11*
ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	99±12*	98±12*
ТШ + ФР***	160±13*	122±10*
ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)	134±11*	114±11*
ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)	122±10*	106±10*
ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)	112±11*	104±11*
ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)	98±9*	94±10*
ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)	110±11*	104+11*
ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)	98±9*	96±10*
*Р<0.02 **Холодовой шок + физиологический раствор ***Тепловой шок + физиологический раствор

Формула изобретения

Циклические пептиды с кортикотропинподобной структурой, проявляющие антистрессовую активность, имеющие следующую аминокислотную последовательность:

Cyclo(Gly¹-Lys²-Val³-Leu⁴-Lys⁵-Lys⁶-Arg⁷-Arg⁸)n,

где n=2-3.