Патент на изобретение №2161044
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ НАПРАВЛЕНИЯ (ИНДУКЦИИ) ИММУННОГО ОТВЕТА, ДНК, ВЕКТОР, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и медицине и может быть использовано для направления клеточного иммунного ответа на инфекционный агент. Млекопитающему вводят трансформированные иммунные клетки, которые экспрессируют химерный рецептор, содержащий внеклеточную часть, способную распознавать инфекционный агент, внутриклеточную часть, происходящую из полипептида CD3, ![]() ![]() ![]() ![]() Настоящее изобретение относится к функциональным T клеточным рецепторам, Fc рецепторам или B клеточным рецепторам химер, которые способны менять направление деятельности иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов за счет экспрессии в указанные клетки химер, которые заставляют клетки реагировать на мишени, распознаваемые химерами. Настоящее изобретение относится также к функциональным T клеточным рецепторам, Fc рецепторам или B клеточным рецепторным химерам, которые способны управлять терапевтическими клетками для специфического распознавания и разрушения либо клеток, инфицированных специфическим инфицирующим агентом, самого инфицирующего агента, опухолевой клетки, или автоиммунно-генерированной клетки. Более конкретно, настоящее изобретение относится к продуцированию T клеточных рецепторов или Fc рецепторов химер, способных заставить цитотоксичные T лимфоциты специфически распознать и лизировать клетки, экспрессирующие протеины HIV оболочки. Поэтому настоящее изобретение предоставляет лечение от таких заболеваний, как AIDS /синдром приобретенного иммунодефицита, СПИД/, которое вызывается вирусом HIV. Предпосылки изобретения Распознавание T клетками антигена за счет рецептора T клетки является основой иммунологии. T клетки управляют тем, что называется клеточным иммунитетом. Он включает разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует целый ряд T клеток, включая “хелперные” и “супрессорные” клетки, которые формируют иммунную реакцию, цитотоксичные /или “киллеры”/ клетки, которые непосредственно убивают ненормальные клетки. T клетки, которые распознают и связывают уникальные антигены, расположенные на поверхности других клеток, становятся активированными; тогда они могут умножаться, и, если это цитотоксичные клетки, они могут убить связанную клетку. Автоиммунное заболевание характеризуется продуцированием либо антител, которые реагируют с тканями хозяина, или иммунных эффекторных T клеток, которые являются автореактивными. В некоторых случаях автоантитела могут возникнуть за счет нормальной T- и B-клеточной реакции, активированной чужими веществами или организмами, которые содержат антигены, которые перекрестно реагируют с аналогичными соединениями в тканях организма. Примерами клинических автоантител являются антитела против ацетилхолиновых рецепторов в Myasthenia gravis; и анти-ДНК, анти-эритроцитные и анти-тромбоцитные антитела при системном lupus erythematorus. HIV и иммунопатогенез В 1984 г. было обнаружено, что HIV является этиологическим агентом AIDS. С того времени определение СПИД было пересмотрено много раз с точки зрения того, какие критерии должны быть включены в диагноз. Однако, несмотря на флуктуации параметров диагностики, простым общим определителем СПИДа является инфицирование HIV и последующее развитие стойких конституциональных симптомов, и определяемые СПИД заболевания, такие, как вторичные инфекции, неоплазмы и неврологические заболевания. Harrizon’s Principles of Internal Medicine 12е изд., Mc. Graw Hill (1991). HIV является ретровирусом человека группы лентивирусов. Четыре распознаваемых ретровируса человека принадлежат к двум различным группам: T лимфотропические /или лейкемия / ретровирусы человека HTLV-1 и HTLV-2, и вирусы иммунодефицита человека, HIV-1 и HIV-2. Первые представляют собой трансформирующиеся вирусы, тогда как последние являются цитопатическими вирусами. HIV-1 был идентифицирован как наиболее часто вызывающий СПИД во всем мире. Соответствие гомологии между HIV-2 и HIV-1 составляет около 40%, причем HIV-2 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита /SJV/. См. Cuman J. et al. Science 329:1357-1359 /1985/; Wеiss R. et al., Nature, 324:572-575 /1986/. HIV содержит обычные ретровирусные гены /env, gag и pol/, а также шесть дополнительных генов, вовлеченных в репликацию и другие биологические активности вирусов. Как было указано ранее, общее определение СПИД состоит в глубокой иммунодепрессии, главным образом, клеточного иммунитета. Подавление иммунитета ведет к различным возможным заболеваниям, особенно к некоторым инфекциям и неоплазмам. Основной причиной иммунодефицита при СПИДЕ, как было обнаружено, является количественный и качественный дефицит субкомплекта лимфоцитов, продуцируемых в тимусе /T/, T4 популяции. Этот субкомплект клеток фенотипически определяется по наличию CD4 поверхностной молекулы, которая как было продемонстрировано, является клеточным рецептором для HIV. Dalgleish et al., Nature, 312: 763 /1984/. Хотя именно T клетки являются основным типом клеток, инфицируемых HIV, важно, что любые клетки человека, которые экспрессируют CD4 молекулу на своей поверхности, способны связываться с HIV и быть инфицированы им. Традиционно, CD4+ T клеткам была приписана роль хелпера/индуктора, что указывало на функцию в обеспечении активирующего сигнала на B клетки, или индуцируя T лимфоциты, которые несут реципрокный CD8 маркер и становятся цитотоксичными/супрессорными клетками. Peilihess and Schlossman Cell, 19: 821-827 /1980/ Goldstein et al., Immunol, Rev. 68:5-42 /1982/. HIV связывается специфически и с высоким сродством, за счет участка секвенирования аминокислот в оболочке вируса /gp 120/, с частью VI участка CD4 молекулы, расположенной вблизи ее N-конца. После связывания, вирус сливается с мембраной мишеневой клетки и интернализируется. После интернализации он использует энзим обратной транскриптазы для транскрипции своей геномной РНК в ДНК, которая внедряется в клеточную ДНК, где и существует в течение жизни клетки в качестве “провируса”. Провирус может оставаться латентным или может быть активирован до транскрипции мРНК и геномной РНК, что ведет к синтезу протеинов, сборке, образованию нового вируса и бадингу вируса с поверхности клетки. Хотя точный механизм, за счет которого вирус вызывает гибель клетки, не установлен, по-видимому, основным механизмом является массивный вирусный бадинг с поверхности клетки, который приводит к разрушению плазмы мембраны и в результате к нарушению осмотического равновесия. Во время инфицирования организм хозяина вырабатывает антитела против протеинов вирусов, включая основные гликопротеины оболочки gp120 и gp 41. Несмотря на этот гуморальный иммунитет, заболевание прогрессирует, что приводит к летальной иммуносуппрессии, которая характеризуется множественными различными инфекциями, паразитемией, слабоумием и смертью. Неспособность анти-вирусных антител хозяина остановить развитие заболевания и представляет один из наиболее тревожных и настораживающих аспектов заболевания и является плохим предзнаменованием для попыток вакцинации на основании обычных приближений. Два фактора могут играть роль в эффективности гуморальной реакции на вирус иммунодефицита. Во-первых, также как и остальные РНК вирусы /и подобно ретровирусам, в частности/, вирусы иммунодефицита демонстрируют высокую степень мутации в ответ на иммунный контроль хозяина. Во-вторых, сами гликопротеины оболочки являются плохо гликозилируемыми молекулами, представляющими несколько эпитопов, подходящих для связывания с высоко афинными антителами. Плохая антигенная мишень, которую представляют оболочки, предоставляет хозяину мало возможностей для ограничения вирусной инфекции за счет продуцирования специфических антител. Клетки, инфицированные вирусами HIV, экспрессируют gp 120 гликопротеин на своей поверхности. Gp 120 способствует актам слияния между CD4+ клетками за счет реакции, аналогичной той, с помощью которой вирус проникает в неинфицированные клетки, что приводит к образованию коротко-живущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития от непосредственного взаимодействия gp 120 гликопротеина оболочки с CD4 протеином. Dalgleish et al., Supra Klatrman D. et all Nature 312:763 (1984); Mc Dougal J.S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski J. et al., Nature, 322:470 (1986); Zifson J.D. et al., Nature, 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature, 321:412 (1986). Доказательством того, что CD4-gp 120 связывание ответственно за вирусную инфекцию клеток, несущих CD4 антиген, включает обнаружение того, что между gp120 и CD4 образуется специфический комплекс. Mc Dougal et al., Supra. Другие исследователи показали, что клеточные линии, которые были неинфективны для HIV, были превращены в инфицируемые клеточные линии для HIV, с последующей трансфекцией и экспрессией CD4 кДНК гена человека. Madolon et al. Cell, 46:333-348 /1968/. T клетки и Fc рецепторы Поверхностная клеточная экспрессия большинства многочисленных форм T клеточного антигенного рецептора /TCR/ требует совместной экспрессии, по крайней мере, 6 различных полипептидных цепей /Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 /1984/; Orloffhashi et al., Nature 316:606-609 /1985/; Berghout et al., J. Biol. Chem., 263:8528 – 8536 /1988/; Sussman et al., Cell, 54: 85-95 /1988/ /; ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Хотя нативные T клетки, В клетки и Fc рецепторы являются, или могут быть, весьма сложными многомерными структурами, не позволяющими проводить с ними обычные манипуляции, настоящее изобретение демонстрирует легкость создания химер между внутриклеточным доменом любой из многочисленных молекул, которые способны выполнять задачу распознавания мишени. В частности, создание химер, состоящих из внутриклеточной части T клетки/ Fc рецепторных зета, эта или гамма цепей, присоединенных к внеклеточной части подходящим образом сконструированных молекул антител, позволяет специфически изменить направление мишеневого потенциала распознавания клеток иммунной системы на распознавание антигена за счет внеклеточного участка антитела. Таким образом, имея участки антител, способные распознавать некоторые детерминанты на поверхности патогенов, клетки иммунной системы, снабженные химерами, будут реагировать на патоген с эффекторной программой соответствующей им линии дифференцировки, например, хелперные T лимфоциты будут реагировать цитотоксичной активностью против мишени, а В лимфоциты будут активизированы на синтез антител. Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свод эффекторные программы, включая выделение цитокина, фагоцитов и вырабатывая реакционноспособный кислород. Аналогично, имея участок антител, способный распознавать опухолевые клетки, реакция иммунной системы на опухоль будет с выгодой усилена. Имея антитела, способные распознавать иммунные клетки, обладающие вредной реакционной способностью с самодетерминантами, автореактивные клетки могут селективно направляться на разрушение. Хотя эти примеры, описывающие использование химер антител в качестве удобного описательного инструмента, настоящее изобретение не ограничивается объемом химер антител, и, естественно, использование специфических неантительных внеклеточных доменов может дать важные преимущества. Так, например, внеклеточная часть, то есть рецептор для вируса, бактерии или паразита, клетки, снабженные химерами, будут специфически поражать клетки, экспрессирующие вирусные, бактериальные или паразитические детерминанты. Выгода такого приближения по сравнению с антителами состоит в том, что нативный рецептор для патогена может иметь уникально высокую селективность или сродство с патогеном, обеспечивая большую степень точности в получении иммунной реакции. Аналогично, для исключения клеток иммунной системы, с неправильными реакциями с самим антигеном, может оказаться достаточным соединить антиген /или его интактный протеин в случае терапии делеции B клеток/ с внутриклеточными зета, эта или гамма цепями, и за счет этого обеспечить специфическое поражение клеток, неправильно реагирующих на свои детерминанты. Другим применением химер является контроль за популяциями клеток in vivo, следующими за другими формами генетического конструирования. Так, например, использование опухолевых инфильтрующих лимфоцитов или природных киллерных клеток для переноса цитотоксинов в определенные участки опухоли, было предложено. Настоящее изобретение обеспечивает удобные средства для регулирования количества и активности таких лимфоцитов и клеток, не удаляя их из организма пациента для амплификации in vivo. Так, благодаря тому, что внутриклеточные домены химерических рецепторов осуществляют пролиферативные реакции клеток, координирование внеклеточных доменов за счет различных стимулов аггрегации, специфичных для внеклеточных доменов /например, антител, специфичных для внеклеточных доменов/ приведет к пролиферации клеток, несущих химеры. Хотя конкретные варианты настоящего изобретения включают химеры между зета, эта и гамма цепями или их активными фрагментами /например, описываемыми далее/, любая рецепторная цепь с аналогичными функциями к этим молекулам, например, гранулоцитам или B лимфоцитам, может быть использована для раскрытых здесь целей. Отличительные характеристики целевых иммунных триггерных молекул включают способность быть автономно экспрессированными /например, как отдельная цепь/, способность сливаться с внеклеточным доменом так, чтобы полученная химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки, и способность инактивировать клеточные эффекторные программы после аггрегации после столкновения с мишеневым лигандом. В настоящее время наиболее удобным способом доставки химер в иммунную клеточную систему является способ, включающий некоторые формы генетической терапии. Однако, реконструирование клеток иммунной системы химерическими рецепторами за счет смешения клеток с подходящим солюбилизированным очищенным химерическим протеином также привело бы в результате к образованию популяций сконструированных клеток, способных реагировать на мишени, распознаваемые внеклеточными доменами химер. Аналогичное приближение можно использовать, например, для введения интактного HIV рецептора, CD4, в эритроциты с терапевтическими целями. В этом случае сконструированные клетки не будут способны к самообновлению. Настоящее изобретение относится к функционально упрощенным T клеточным рецепторным, B клеточным рецепторным и Fc клеточным рецепторным химерам, которые способны изменять направление действия иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов за счет экспрессии в указанные клетки химер, которые вызывают клеточную реакцию на мишени, распознаваемые химерами. Настоящее изобретение относится также к способу направления клеточной реакции на инфицирующий агент, опухолевые или канцерогенные клетки, или на клетки, вырабатываемые автоиммунно. Способ управления клеточной реакцией у млекопитающих включает введение эффективного количества терапевтических клеток указанному млекопитающему, причем указанные клетки способны распознавать и разрушать указанный инфицирующий агент, опухолевые, раковые клетки или автоиммунно генерированные клетки. В другом варианте способ направления клеточной реакцией на инфицирующие клетки включает введение терапевтических клеток, которые способны распознавать и разрушать указанный агент, причем агентом является специфический вирус, бактерия, простейшее или грибок. Еще более конкретно, способ направлен против таких агентов, как HIV и Pneumocystis carinii. Специфически настоящее изобретение предлагает способ направления клеточной реакции на клетки, инфицированные HIV. Способ включает введение пациенту эффективного количества цитотоксичных T лимфоцитов, причем указанные лимфоциты способны специфически распознавать и подвергать лизису клетки, инфицированные HIV. Таким образом, в одном из вариантов, настоящее изобретение представляет способ направления клеточной реакции на клетки, инфицированные HIV, включающий введение пациенту эффективного количества цитотоксичных T лимфоцитов, которые способны специфически распознавать и подвергать лизису клетки, инфицированные HIV. В еще одном варианте изобретения предложены химерические рецепторные протеины, которые направляют цитотоксичные T лимфоциты на распознавание и лизис клеток, инфицированных HIV. Еще один вариант изобретения включает клетки хозяина, трансформированные вектором, содержащим химерические рецепторы. В еще одном варианте настоящее изобретение предлагает антитела против химерических рецепторов настоящего изобретения. Для получения цитотоксичных T лимфоцитов, которые специфически связывают и разрушают клетки, инфицированные HIV, авторы изобретения испробовали рецепторные химеры. Эти химерические рецепторы функционально активны и обладают экстраординарной способностью специфически связывать и разрушать клетки, экспрессирующие gp120. Еще одной целью настоящего изобретения стало создание способа лечения индивидуумов, инфицированных HIV. В настоящем изобретении предложен ряд важных достижений в лечении СПИДа. Эти и другие нелимитирующие варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам из последующего подробного описания изобретения. В нижеследующем подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологии, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, представленные далее для таких методик, на которые сделаны ссылки, включены сюда по ссылкам на их содержание. Стандартные работы, в которых суммированы общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, включают: Watson, J. D, et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Bеnjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc. , Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y, (1985); Old, R.W., et al,. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. , et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989). Определения Под “клонированием” подразумевают in vitro рекомбинантную методику включения конкретного гена или другой ДНК последовательности в векторную молекулу. Для успешного клонирования целевого гена, необходимо использовать способы создания ДНК фрагментов для соединения этих фрагментов с векторной молекулой, для введения композитной ДНК молекулы в клетки хозяина, в которых они могут реплицироваться, и для отбора клона, содержащего мишеневый ген из реципиентных клеток хозяина. Под “кДНК” подразумевают комплемент или копию ДНК, полученную из РНК темплата под действием РНК зависимой ДНК полимеразы /обратной транскриптазы/. Так, “кДНК клон” означает дуплексную ДНК последовательность, комплементарную РНК молекуле вставки, содержащей клонирующий вектор. Под “кДНК библиотекой” подразумевают коллекцию рекомбинантных ДНК молекул, содержащих кДНК вставки, которые содержат ДНК копии иРНК, которые были экспрессированы клеткой во время создания кДНК библиотеки. Такую кДНК библиотеку можно получить способами, известными специалистам и описанными, например, в Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual supra. Обычно РНК вначале выделяют из клеток организма, из генома которого предстоит клонировать конкретный ген. Предпочтительными для целей настоящего изобретения являются клеточные линии лимфоцитов млекопитающих и особенно человека. Предпочтительным вектором для этой цели является штамм вакцины вируса WR. Под “вектором” подразумевают молекулу ДНК, полученную, например, из плазмид, бактериофагов или вирусов человека или насекомых, в которую можно включить или клонировать фрагменты ДНК. Вектор должен содержать один или более из рестрикционных сайтов и может быть способен автономно реплицироваться в определенном организме хозяина или носителя, таким образом, чтобы клонированная последовательность была репродуцируема. Так, под термином “вектор экспрессии ДНК” подразумевают автономный элемент, способный направлять синтез рекомбинантных пептидов. Такие ДНК векторы экспрессии ДНК включают бактериальные плазмиды и плазмиды и вирусы млекопитающих и насекомых. Под “практически чистым” понимают соединение, например, протеин, полипептид или антитела, которые практически не содержат компонентов, которые в природе их сопровождают. Обычно соединение называют практически чистым, если, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 75%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% всего материала составляет представляющее интерес соединение. Чистоту определяют соответствующими способами, например, с помощью хроматографии на колоннах, электрофореза в полиакриламидном геле или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии /HPLC = ВЖХ/. Если это касается нуклеиновых кислот, термин “практически чистый” относится к последовательности нуклеиновой кислоты, сегменту ее или фрагменту, который не содержит генов, который фланкирует ее в ее природно-встречающемся состоянии /например, не содержит последовательностей, которые фланкируют нуклеиновую кислоту в ее нативном геномном положении/. Под “функциональным производным” подразумевают “фрагменты”, “варианты”, “аналоги” или “химические производные” молекулы. “Фрагмент” молекулы, например, кДНК последовательности настоящего изобретения, означают, что этот термин относится к любому нуклеотидному субсету молекулы. “Вариант” такой молекулы относится к природно встречающейся молекуле, практически аналогичной либо целой молекуле, либо ее фрагменту, “Аналог” молекулы относится к не-активной молекуле, практически аналогичной либо всей молекуле, либо ее фрагменту. Говорят, что молекула “практически аналогична” другой молекуле, если последовательность аминокислот в обеих молекулах практически одинакова. Практически аналогичные молекулы аминокислот будут обладать аналогичными биологическими активностями. Так, при условии, что две молекулы обладают аналогичными активностями, их считают вариантами, так как этот термин используют даже, если одна молекула содержит дополнительно /или меньше/ аминокислотные остатки, которые не найдены в другой, или если последовательность аминокислотных остатков не идентична. В том смысле, как здесь использовано, говорят, что молекула является “химическим производным” другой молекулы, если она содержит дополнительные химические фрагменты, которые обычно не составляют части этой молекулы. Такие фрагменты могут повысить растворимость молекул, адсорбцию, биологическую полужизнь и т.д. Эти фрагменты в другом варианте могут снизить токсичность молекулы, исключить или ослабить любые нежелательные побочные эффекты молекулы и т.д. Фрагменты, способные осуществить такие эффекты, раскрыты, например, в Reminston’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. Mack Publishing Co., Easton, Peuu (1980). Аналогично, “функциональное производное” рецептора химеры настоящего изобретения подразумевает “фрагменты”, “варианты” или “аналоги” гена, который может быть “практически аналогичен” нуклеотидной последовательности и который кодирует молекулу, обладающую аналогичной активностью с, например, T клеточными, B клеточными или Fc рецепторными химерами. Так, в том смысле, как здесь использовано, T клеточные, B клеточные или Fc рецепторные химерические протеины также включают любые функциональные производные, варианты, аналоги или химические производные, которые могут быть существенно аналогичны “дикого типа” химерам и которые обладают аналогичной активностью, то есть, наиболее предпочтительно 90%, более предпочтительно 70%, предпочтительно 40% или, по крайней мере, 10% активности дикого типа рецепторных химер. Активность функциональных химерических рецепторных производных включает специфическое связывание /с их внеклеточной частью/ с мишеневым агентом и в результате разрушение /направляемое его внутриклеточной или трансмембранной частью/ агента или клетки; причем такую активность можно определить, используя любые аналитические способы, описанные далее. ДНК последовательность, кодирующую T клеточные, B клеточные или Fc рецепторные химеры настоящего изобретения, или их функциональные производные, можно рекомбинировать вектором ДНК в соответствия с обычными способами, включая тупые концы или болтающиеся концы для лигирования, расщепления рестрикционным энзимом до получения соответствующих концов, заполняя их липкими концами соответствующим образом, обрабатывая щелочной фосфатазой во избежание нежелательных присоединений, и лигирования соответствующей лигазой. Методики таких манипуляций раскрыты Maniatis T., et al: supra, и хорошо известны специалистам. Говорят, что молекулы нуклеиновых кислот, такие как ДНК, “способны к экспрессии” полипептида, если они содержат нуклеотидную последовательность, которая содержит транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, и такие последовательности являются “операбельно связанными” с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептид. Операбельной связью является такая связь, в которой регуляторные ДНК последовательности и ДНК последовательности, которые нужно экспрессировать, связаны таким образом, чтобы обеспечить экспрессию гена. Точная природа регуляторных участков, необходимых для экспрессии гена, может меняться от организма к организму, но должна, вообще, включать промоторный участок, который, у прокариотов, содержит оба промотора /которые руководят инициированием РНК транскрипции/, а также ДНК последовательности, которые будучи транскрибированы в РНК, дадут сигнал начала синтеза протеина, такие участки обычно включают те 5′-некодирующие последовательности, которые связаны с инициированием транскрипции и трансляции, такие как TATA, CAAT последовательности и т.п. При желании, некодирующий 3′-участок генной последовательности, кодирующий протеин, можно получить вышеописанными способами. Этот участок можно сохранить для его трансляционной терминационной регуляторной последовательности, например, для терминации и полиаденилирования. Так, сохраняя 3′-участок, смежный с ДНК последовательностью, кодирующей протеин, можно получить сигналы окончания транскрипции. Если сигналы окончания транскрипции функционируют недостаточно при экспрессии клеток хозяев, тогда 3′-участок, функциональный в клетках хозяина, можно заменить. Считают, что две ДНК последовательности /такие как последовательность промотерного участка и T клеточный рецептор, B клеточный рецептор или Fc рецепторная химера, кодирующая последовательность/ операбельно связаны, если природа связи между двумя ДНК последовательностями /1/ не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, /2/ не мешает способности промотерного участка последовательности управлять транскрипцией рецепторной химерической генной последовательности, или /3/ не мешает способности рецепторной химерической генной последовательности быть транскрибированной промотерным участком последовательности. Промотерный участок должен быть операбельно связан с ДНК последовательностью, если промотер был способен осуществлять транскрипцию ДНК последовательности. Таким образом, для того чтобы осуществить экспрессию протеина, необходимы транскрипционный и трансляционные сигналы, распознаваемые соответствующим хозяином. Настоящее изобретение охватывает экспрессию T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецепторного химерического протеина /или их функциональных производных/ либо в прокариотические, либо в эукариотические клетки, хотя предпочтительна экспрессия в эукариотические /и особенно, лимфоцитов человека/ клетки. Антитела по способу настоящего изобретения можно получить любым из множества различных способов. Так, например, клетки, экспрессирующие рецепторный химерический протеин, или его функциональные производные, можно ввести животным для того, чтобы вызвать продуцирование сыворотки, содержащей поликлональные антитела, которые способны связывать химеры. Антитела по способу настоящего изобретения также могут быть поликлональными или, предпочтительно, региоспецифическими поликлональными антителами. Антитела против T клеточных рецепторов, B клеточных рецепторов или Fc рецепторов химер по способу настоящего изобретения можно использовать для слежения за количеством химерических рецепторов /или химерические рецепторы содержащих клеток/ у пациента. Такие антитела прекрасно приспособлены для использования в стандартном иммунодиагностическом анализе, известны специалистам, включают такие иммунометрические или “сэндвичевые” анализы, как опережающий сэндвичевый, обратный сэндвичевый и одновременный сэндвичевый анализы. Антитела можно использовать в любой из их комбинаций, которые могут определить специалисты, без ненужных экспериментов для осуществления иммуноанализа приемлемой специфичности, чувствительности и точности. Стандартные работы, в которых изложены общие принципы иммунологии, включают: 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984); Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982); and Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980). Roitt, I., Essential Immunology, Sixth Ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, J. W., Introduction to Immunology, Second Ed. , Macmillan Publishing Co. , Publisher, New York (1986); Roitt. I., et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd,, Publisher, London, (1985); Campbell, A., “Monoclonal Antibody Technology”, in, Burdon, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular, Biology, Volume. Под “детектированием” подразумевают определение наличия или отсутствия вещества или количественное определение его содержания. Этот термин относится к использованию материалов, композиций и способов настоящего изобретения для качественных и количественных определений. Для репликации гибридные клетки можно культивировать как in vitro, так и in vivo. Высокая продуктивность in vivo делает этот способ предпочтительным способом культивирования. Короче, клетки из отдельных гибридных штаммов вводят внутрибрюшинно мыши pristane – primed BALB/с для получения асцитной жидкости, содержащей высокие концентрации целевых моноклональных антител. Моноклональные антитела изотипов IgM или IgG можно очистить из надосадочной жидкости культуры, используя хроматографические способы, хорошо известные специалистам. Антитела по способу настоящего изобретения особенно пригодны для использования в иммуноанализах, где их можно использовать в жидкой фазе, или связанными с твердой фазой носителя. Кроме того, антитела в этих иммуноанализах можно детектируемо метить различными способами. Существует множество меток и способов мечения, известных специалистам. Примеры такого типа меток, которые можно использовать в способе настоящего изобретения, включают, хотя и не ограничиваются ими, ферменты, радиоизотопы, флюоресцирующие соединения, хемилюминесцирующие соединения, биолюминесцирующие соединения и халаты металлов. Специалистам известны и другие возможные метки для связывания с антителами, или можно определить то же самое с использованием рутинных экспериментов. Более того, связывание таких меток с антителами можно осуществить, используя стандартные методики, обычно известные специалистам. Одним из таких способов настоящего изобретения, с помощью которого можно детектируемо пометить антитело, является способ связывания его с энзимом. Этот энзим, в свою очередь, будучи позднее экспонирован субстрату, будет реагировать с субстратом таким образом, что приведет к образованию химического фрагмента, который можно детектировать, например, спектроскопическими или флуорометрическими способами. Примеры энзимов, которые можно использовать для детектируемой метки антител, включают малатдегидрогеназу, стафилококкалнуклеазу, дельта- ![]() глюкозо-VI-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Наличие детектируемо меченых антител можно также определить, пометив антитела радиоактивными изотопами, которые затем определяют с помощью гамма-счетчиков или сцинтилляционных счетчиков. Изотопы, наиболее пригодные для целей настоящего изобретения: 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe и 75Se. Возможно также определять связывание детектируемо меченых антител путем введения метки флуоресцентного соединения в антитело. Если флуоресцентно меченое антитело экспонируют свету соответствующей длины волны, его присутствие можно определить за счет флуоресценции красителя. Среди наиболее часто используемых флуоресцентно меченых соединений находятся флуоресцин, изотиоциан, родамин, фикоэретрин, фикоцианин, аллофикоцианин орто-фтальдегид и флуоресцамин. Антитела настоящего изобретения можно также детектируемо пометить, используя такие флуоресцирующие металлы, как 152Eu, или другие лантаноиды. Эти металлы можно присоединить к антителам, используя такие хелатирующие группы, как диэтилэнтериаминпентауксусная кислота /DTPA/ или этилендиаминтетрауксусная кислота /EDTA/. Антитела можно также детектируемо пометить, соединяя их с хемилюминесцентными соединениями. Наличие хемилюминесцентных антител определяют затем, детектируя наличие люминесценции, возникающей в процессе химической реакции. Примеры наиболее подходящих хемилюминесцентных метящих соединений включают люминал, изолюминол, сложный эфир тероматикакридиния, имидазол, соли акридиния, сложный оксалатный эфир и диоксэтан. Аналогично, для того чтобы пометить антитела по способу настоящего изобретения, можно использовать биолюминесцентные соединения. Биолюминесценция представляет собой тип хемилюминесценции, возникающей в биологических системах, в которых каталитический протеин повышает эффективность реакции хемилюминесценции. Наличие биолюминесцентных антител определяют, детектируя наличие люминесценции. Важные биолюминесцентные соединения для целей введения меток включают люциферин, люциферин, люциферазаекворин. Антитела и практически очищенные антигены настоящего изобретения идеально подходят для приготовления набора. Такой набор может содержать контейнер, разделенный на отделения, для размещения ампул, трубок и т.п., причем каждый контейнер содержит отдельные элементы, которые используют при анализах. Типы анализов, для которых можно использовать этот набор, включают, например, конкурентный и неконкурентный анализы. Типичные примеры анализов, в которых можно использовать антитела настоящего изобретения, включают радиоиммуноанализ /RIA/, энзимативный иммуноанализ /EIA /, иммуносорбентный со связанным энзимом анализ /ELISA/ и иммунометрический, или сэндвичевый иммуноанализ. Под термином “иммунометрический анализ” или “сэндвичевый иммуноанализ” подразумевают, что он одновременно включает сэндвичевый, опережающий сэндвичевый и обратный сэндвичевый иммуноанализы. Эти термины хорошо знакомы специалистам. Специалистам понятно также, что антитела по способу настоящего изобретения будут полезны в различных вариантах и формах анализов, которые уже известны или которые можно разработать в будущем. Они также включены в объем изобретения. В предпочтительном варианте осуществления анализа важно, чтобы в инкубируемой среде присутствовали определенные “блокеры” /которые обычно добавляют с меченым растворимым антителом/. Такие “блокеры” добавляют для того, чтобы неспецифические протеины, протеазы или антитела человека к мышиным иммуноглобулинам, присутствующим в экспериментальном образце, не сшивали или не разрушали антитела на твердой фазе носителя или радиомеченные индикаторные антитела, и не давали бы неверные положительные или неверные отрицательные результаты. Поэтому выбор “блокеров” существенно добавляет специфичности к анализам, рассматриваемым в настоящем изобретении. Было обнаружено, что ряд нерелевантных /то есть, неспецифичных/ антител того же класса или подкласса /изотипа/, что и те, которые используют в анализе /например, IgG1, IgG2, IgM и т. д./, можно использовать в качестве “блокеров”. Концентрация “блокеров” /обычно 1 – 100 мкг/мл/ важна для поддержания соответствующей чувствительности, и все еще ингибирует любые нежелательные вмешательства за счет обычно встречающихся перекрестно-реакционноспособных протеинов в сыворотке человека. Кроме того, буферная система, содержащая “блокеры”, нуждается в оптимизации. Предпочтительными буферам являются буфера на основе органических кислот, такие как имидазол, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS и тому подобные в интервале физиологических значений pH. Несколько менее предпочтительными буферами являются такие неорганические буферы, как фосфаты, бораты или карбонаты, и наконец, известные ингибиторы протеазы необходимо добавить /обычно 0,01 – 10 мкг/мл/ к буферу, который содержит “блокеры”. Существует множество иммуноадсорбентов, которые можно использовать и которые можно применить в способе настоящего изобретения. Хорошо известные иммуноадсорбенты включают стекло, полистирол, полипропилен, декстран, найлон или другие материалы в форме трубочек, шариков и микропластиков, изготовленных из или покрытых такими материалами и т.п. Иммобилизованные антитела можно либо ковалентно либо физически связать с твердой фазой иммуноадсорбента методиками, известными, например, ковалентным связыванием через амидную или сложноэфирную связь, или адсорбцией. Специалистам известно множество других подходящих твердофазных адсорбентов и способов иммобилизации на них антител, или они могут выполнить таковые, используя всего лишь рутинные эксперименты. Для диагнозов in vivo, in vitro или in situ метки, такие как радионуклиды, можно связать с антителами по способу настоящего изобретения либо непосредственно, либо используя промежуточные функциональные группы. Промежуточной группой, которую часто используют для связывания радиоизотопов, которые существуют в виде катионов металлов, с антителами, является диэтилентриаминпентауксусная кислота /DTPA/. Типичные примеры катионов металлов, которые связывают таким образом, включают 99мTc, 123I, 111In, 131I, 9797Ru, 67Cu, 67Ga и 68Ga. Антитела настоящего изобретения можно также метить нерадиоактивными изотопами для диагностических целей. Элементы, которые наиболее подходят в таком случае: 157Gd, 55Mn, 162Dy, 53Cr и 5656Fe. Антиген настоящего изобретения можно выделить в практически чистом виде, используя антитела по способу настоящего изобретения. Так, в одном из вариантов настоящего изобретения, предложенном для практически чистых T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецептора химеры, указанный антиген, отличающийся тем, что его распознают и связывают антитела настоящего изобретения. В другом варианте настоящее изобретение обеспечивает способ выделения или очистки рецепторного химерического антигена за счет образования комплекса указанного антигена с одним или более из антител, направленных против рецепторной химеры. Практически чистые антигены T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецептора химеры настоящего изобретения можно, в свою очередь, использовать для определения или измерения антител к химерам в образце, например, в сыворотке или в моче. Таким образом, один из вариантов настоящего изобретения включает способ определения наличия или количества антител к рецепторному химерическому антигену в образце, который включает контактирование образца, содержащего антитела, к химерическому антигену, с детектируемо меченной рецепторной химерой, и детектирование указанной метки. Следует учитывать, что иммунореактивные фракции и иммунореактивные аналоги химер также можно использовать. Под термином “иммунореактивные фракции” подразумевают любую часть химерического антигена, которая демонстрирует эквивалентную иммунную реакцию на антитела, направленные против рецепторных химер. Под термином “иммунореактивные аналоги” подразумевают протеины, которые отличаются от протеинов рецепторных химер одной или более аминокислотами, но которые демонстрируют эквивалентную иммунную реакцию на антитела настоящего изобретения. Под выражением “специфически распознают и связывают” подразумевают антитела, которые распознают и связывают химерический рецепторный полипептид, но которые практически не распознают и не связывают другие молекулы в образце, например, в биологическом образце, который включает рецепторный полипептид. Под выражением “автоиммунно-генерированная клетка” подразумевают клетки, продуцирующие антитела, которые реагируют с тканями хозяина или иммуноэффекторные клетки, которые являются автореактивными; такие клетки включают антитела против ацетилхолиновых рецепторов /ведущих, например, к myasthehia gravis/ или анти-ДНК, анти-эритроцит и анти-тромбоцитные антитела /ведущие, например, к lupus erythematosus/. Под термином “терапевтические клетки” подразумевают клетки, которые были трансформированы химерами настоящего изобретения таким образом, что они способны распознавать и разрушать специфический инфицирующий агент, клетки, инфицированные специфическим агентом, опухолевые или канцерогенные клетки, или автоиммунно-генерированные клетки; предпочтительно такими терапевтическими клетками являются клетки системы гомепоэза /кроветворные/. Под термином “внеклеточный” подразумевают содержащий, по крайней мере, часть молекулы, экспонированной на поверхности клетки. Под термином “внутриклеточный” подразумевают содержащий, по крайней мере, часть молекулы, экспонированной терапевтическим клеткам цитоплазмы. Под термином “трансмембранный” подразумевают содержащий, по крайней мере, часть молекулы, пронизывающей плазму мембраны. “Внеклеточная часть” и “внутриклеточная часть” и также “трансмембранная часть” в том смысле как здесь использованы, могут включать фланкирующие аминокислотные последовательности, которые простираются в прилегающие отделы клетки. Под термином “олигомеризованный” подразумевают комплекс с другими протеинами с образованием димеров, тримеров, тетрамеров или других высших олигомеров. Такие олигомеры могут быть гомо-олигомерами или гетероолигомерами. Олигомеризующий участок представляет собой тот участок молекулы, который управляет образованием комплекса /то есть, олигомера/. Под термином “цитолитический” подразумевают способный разрушить клетку /например, клетку, инфицированную патогеном, опухолевую или канцерогенную клетку, или автоиммуно-генерированную/ или способный разрушить инфицирующий агент /например, вирус/. Под “вирусом иммунодефицита” подразумевают ретровирусы, которые в форме дикого типа способны инфицировать T клетки хозяина-примата, и обладают вирусным морфогенезом и морфологическими характеристиками подсемейства лентивирусов. Этот термин включает, без ограничений, все варианты HIV и SIV, включая HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVSmm, SIVman, SIVmand и SIVcpz. Под термином “МНС-зависимый” подразумевают, что клеточная цитолитическая реакция не требует присутствия какого-либо МНС класса II антигена на поверхности мишеневой клетки. Под термином “функциональное цитолитическое сигнально-трансдукторное производное” подразумевают функциональное производное /как было определено ранее/, которое способно управлять, по крайней мере, 10%, предпочтительно, 40%, более предпочтительно, 70%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% биологической активности дикого типа молекулы. В том смысле, как здесь использован, “функциональное цитолитическое сигнал-трансдукторное производное” может посылать непосредственно сигнал терапевтической клетке разрушить связанный с рецептором агент или клетку /например, в случае внутриклеточной химерической рецепторной части/ или может действовать косвенно, промотируя олигомеризацию цитолитического сигнального трансдукторного протеина терапевтической клетки /например, в случае трансмембранного домена/. Такие производные можно тестировать на эффективность, например, используя in vitro анализ, описанный здесь. Под “функциональным производным связывающим оболочку HIV” подразумевают функциональное производное /как определено ранее/, которое способно связывать любой протеин оболочки HIV. Функциональные производные можно идентифицировать, используя например, in vitro анализ, описанный здесь. Терапевтическое введение Трансформированные клетки настоящего изобретения можно использовать для лечения ряда заболеваний. Текущие способы введения таких трансформированных клеток включают адаптационную иммунотерапию или терапию переноса клеток. Эти способы позволяют вернуть иммунотрансформированные системы клеток в поток крови. Roseuberg, S.A. Scientific Amerian, 62 (May 1990); Roseuberg, et al., The New Englang Journal of Medicine, 323 (9): 570 (1990). Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить любому животному, которое может извлечь благоприятное воздействие от соединений настоящего изобретения. Прежде всего, среди животных следует назвать человека, хотя настоящее изобретение этим не ограничивается. Клинические данные Cell Genesys по первоначальным испытаниям фазы II, в ходе которых исследовали пациентов с определяемым, несмотря на проводимую противоретровирусную лекарственную терапию содержанием ВИЧ в крови, свидетельствуют о безопасности проводимого лечения и сохранности генетически модифицированных T-клеток в циркуляторном русле, по крайней мере, в течение 100 суток после введения клеток. Были отмечены предварительные признаки противовирусной активности с тенденцией к снижению содержания ВИЧ в лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта, основного резервуара ВИЧ-инфицированных клеток, у четырех из пяти исследуемых пациентов”. Впоследствии та же рабочая группа сообщила о дальнейших проведенных клинических испытаниях Фазы II. В указанных последующих испытаниях участвовали 40 пациентов. 20 из них получали лечение в виде однократного введения экспрессирующих химерный рецептор T-клеток, а 20 контрольным пациентам вводили немодифицированные T-клетки. Результаты оценивали спустя 6 месяцев. В результате данных исследований выяснилось, что рецидив заболевания наблюдался лишь у 5 из 20 пациентов, которым вводили экспрессирующие химерный рецептор T-клетки, по сравнению с 10 из 20 в контрольной группе. Далее, у пациентов, получавших лечение в виде однократного введения экспрессирующих химерный рецептор T-клеток, по прошествии 6 месяцев наблюдалось как среднее 0,4 log отрицательное отклонение количества ВИЧ, высылаемого из циркулирующих клеток крови, от контрольных значений (p=0,02), так и среднее log отрицательное отклонение содержания ДНК ВИЧ, определяемой в биоптатах прямой кишки (p= 0,007), от контрольных значений. У пациентов, получавших контрольные немодифицированные T-клетки, существенные отклонения от контрольных значений в обоих исследованиях не наблюдались. Подробное описание изобретения Вначале описывается содержание чертежей. Краткое описание чертежей Фиг. 1 Характеристика CD4 химер. На фиг. 1A представлена аминокислотная последовательность вокруг сайта слияния между CD4 /остатки 1-369/ и различными рецепторными цепями. Подчеркнутая последовательность показывает положение аминокислот, закодированных внутри BamHI сайта, использованного для конструкции слияния. Начало трансмембранного домена отмечено вертикальной чертой. ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Конструирование IgG1 человека: рецепторные химеры Получают тяжелые цепные последовательности человеческого IgG1, соединяя последовательности в CH3 домене с кДНК фрагментом, полученным из 3′ конца трансмембранной формы иРНК антител. 3′ концевой фрагмент получают в цепной полимеразной реакции, используя библиотеку кДНК из миндалин в качестве субстрата, и олигонуклеотиды, с последовательностями: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTC GGC /SEQ ID N0:7/ и CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCC CGT CCT GGG CCT CA /SEQ ID N0: 8/, соответствующие 5′ и 3′ концам целевых фрагментов ДНК, соответственно. 5′ олигокомплементарен сайту в CHI домене человеческого IgC1, а 3′ комплементарен сайту 5′ последовательности, кодирующей мембранный спанинговый домен. PCR продукт переваривают с BStXI и BamHI и лигируют между CStXI и BamHI сайтами полусинтетического гена антитела IgG1, несущего переменные и постоянные участки. После включения фрагмента BStXI до BamHI, амплифицирующую часть конструкции заменяют вплоть до Smal сайта в CH3 рестрикционным фрагментом взаимообмена, так, что только участок между Smal сайтом и 3′ олиго получают из PCR реакции. Для создания человеческого IgC1: ![]() ![]() ![]() ![]() CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC /SEQ ID N0:9/ и CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAC CAG /SEQ ID N0:10/ по 5′ и 3′ концам, соответственно. Полимеразные цепные реакции с этими олигомерами проводят в присутствии 10% диметилсульфоксида. Фрагмент, полученный за счет PCR, переваривают с Wotl и Hincll и включают между Notl и Hpal сайтами после последовательности, кодирующей IgG1 человека. Последовательности, кодирующие кДНК легкой цепи IgG1 каппа человека, включают затем после grp78 лидера, используя Hincll сайт и другие сайты в векторе. Плазмида экспрессии, полученная в результате этих манипуляций, состоит из синтетического гена тяжелой цепи с последующей grp78 лидерной последовательностью, с последующей последовательностью кДНК легкой цепи каппа, с последующими сигналами полиаденилирования, полученными из SV40 ДНК фрагмента. Трансфекция COS клеток экспрессионной плазмидой дает заметно повышенную экспрессию детерминант тяжелой цепи, по сравнению с трансфекцией плазмид, кодирующих только детерминанты тяжелой цепи. Для создания bicistronic гена, содержащего тяжелую цепь/рецепторную химеру, и легкую цепь, расположенные ранее, последовательности тяжелой цепи можно заменить любым химерическим тяжелая цепь/рецепторным геном, здесь описанным. Пример 2 Конструирование CD4 рецепторных химер Человеческие Z (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9709-9713 (1998b)) и ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() CD4 химеры можно ассоциировать с другими рецепторными цепями Клеточная поверхностная экспрессия макрофаг /природная киллерная клеточная форма Fc ![]() ![]() Asp Z мутанты не ассоциируются совместно с Fc рецептором Для создания химер, которые не ассоциировались бы с существующими антигенами или Fc рецепторами, мутантный Z слитый протеин, который не содержит ни внутримембранного Asp, ни внутримембранного Cys остатка, был получен. Цитометрия в потоке показывает, что интенсивность экспрессии клеточной поверхности за счет различных мутантных химер заметно не отличается от не мутантов-предшественников /данные не приведены/, а эксперименты по иммуноосаждению показали, что полная экспрессия за счет химер была такой же /фиг. 3/. Как и ожидалось, мутантные химеры, не содержащие трансмембранного остатка цистеина, как было обнаружено, не образуют димеров с дисульфидной связью /фиг. 3/. Две мутантные химеры, не содержащие Asp, были неспособны поддержать поверхностную экспрессию CD16, тогда как мономерные химеры, не содержащие Cys, но несущие Asp, обеспечили совместную экспрессию CD16TM, но с более низкой эффективностью, нежели родительский димер /фиг. 3/. Пример V Мутантные рецепторы сохраняют способность инициировать реакцию кальция Для того чтобы определить, позволит ли сшивка слитых протеинов обеспечить аккумуляцию внутриклеточного кальция таким же образом, который известен для T клеточных антигенных рецепторов, клетки линии T клеточной лейкемии человека, Jurkat E6 3ATCC Access or Number TIB 152, American Tyрe Culture Collection, Rockviell, MD/, инфицировали рекомбинантами вакцины, и измеряли относительную концентрацию кальция в цитоплазме после сшивки внеклеточного домена с антителами. Осуществляли цитометрические измерения в потоке на клетках, с введенным чувствительным к кальцию красителем lnoo-1 /Grynkievich et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 /1985/; Rabinovitch et al., J. Immunol, 137: 952 – 961 /1986/ /. На фиг. 4 представлены результаты по кальцию в экспериментах в потоке с клетками, инфицированными CD4:Z и Asp– и Gys– мутантами Z. Сшивка химер воспроизводимо повышает внутриклеточный кальций. CD4: ![]() ![]() CD4: Z, ![]() ![]() Для определения того факта, будут ли химерические рецепторы включать цитолитическую эффекторную программу, была создана модель мишень:эффекторная система на основе CD4 распознавания комплекса HIV оболочка gp120/gp41. HeLa клетки были инфицированы рекомбинантными вирусами вакцины, экспрессирующими gp120/gp41 /Chakrobarti et al., Nature 320:535 – 537/1986/; Earl et al., J. Virol, 64:2449 – 2451 /1990/ и помечены 51Cr. Меченые клетки инкубировали с клетками человеческой аллоспецифической /CD8+, CD4–/ клеточной линии цитотоксических T лимфоцитов, которые были инфицированы рекомбинантами вакцины, экспрессирующими CD4: Z, CD4: ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Клетки, содержащие МНС, класс II, не поражаются химерами ![]() Требования последовательности для индукции цитолиза T клеточным антигеном/Fc рецептором зета цепи Хотя химеры между CD4 и Z можно снабдить цитотоксичными T лимфоцитами /CTL/ для убийства мишеневых клеток, экспрессирующих HIV gp120, ищут альтернативу CD4 для однозначного сравнения свойств зета химер, введенных в T клеточные линии человека. Такие линии могут экспрессировать CD4, затрудняя специфическое определение связи между ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Трансдукция цитолитического сигнала Fc рецептором человека Для оценки действий различных человеческих Fc рецепторных субтипов, были созданы химерические молекулы, в которых внеклеточный домен антигенов человека CD4, CD5 или CD16 был соединен с трансмембранными и внутриклеточными доменами FcR11 ![]() CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID N0: 19; FcR11A reverse); GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID N0: 20; FcR11B1 and FcR11B2 forward); and GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID N0: 21; FcR11B1 and FcR11B2 reverse). TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID N0: 22) and TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID N0: 23). Эти праймеры содержат сайты расщепления для энзимов BamHI и Notl, соответственно, отступив на 6 остатков от 5′ конца. Сайт Notl следует сразу за противосмысловым стоп кодоном либо CTA, либо TTA. Все праймеры содержат 18 или более остатков, комплементарных 5′ концу и 3′ концу целевого фрагмента. кДНК фрагмент, соответствующий FcR11 ![]() TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A /SEQ ID N0: 22/ и TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A /SEQ ID N0: 23/. PCR фрагменты были включены в векторы экспрессии вируса вакцины, которые содержали CD16 или CD4 внеклеточные домены, соответственно, а затем были включены в дикого типа вакцину за счет рекомбинации по тимидинкиназному локусу, с использованием селекции по коинтеграции E.coli gpt для облегчения идентификации целевых рекомбинант. Идентификация всех изоформ /представлены на фиг. 12/ была подтверждена дидеоксисеквенированием. Получение химерических рецепторных протеинов было далее подтверждено исследованиями иммуноосаждения. Приблизительно 107 JRT3.T3.5 клеток было инфицировано в течение одного часа в среде IMDM не содержащей сыворотки, рекомбинантной вакциной при умножаемости инфекции, по крайней мере, 10. Спустя 12 часов после заражения, клетки собрали, и поверхности пометили 0,5 мКюри 125I на 107 клеток, используя способ лектопероксидаза /глюкозооксидаза /Clark and Einfeld, supra/. Меченые клетки собрали центрифугированием и лизировали 1% NP-40, 0,1 мM MgCl2, 5 мМ KCl, 0,2 М иодоацетамида и 1 мМ PMSF. Ядра удалили центрифугированием, а CD16 слитые протеины иммуноосадили антителами 4G8 и анти-мышиной IgG агарозой. Образцы обработали электрофоретически при мягких условиях. Все иммуноосажденные химерические рецепторные молекулы были ожидаемой молекулярной массы. Для проверки способности химерических рецепторов осуществлять повышение содержания цитоплазмических свободных ионов кальция, использовали рекомбинантные вирусы для заражения TCR– мутантной Jurkat клеточной линии JRT3.T3-5 /как показано далее/, и содержание цитоплазмического свободного иона кальция определяли в клетках /как здесь описано/ с последующей сшивкой рецепторных внеклеточных доменов с моноклональными антителами 3G8 или Leu-3A /как здесь описано/. Эти эксперименты показали, что внутриклеточные домены FcR ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Другие внутриклеточные и трансмембранные сигнальные домены трансдукции по способу настоящего изобретения можно получить из протеинов T клеточных рецепторов, CD3 дельта и T3 гамма, и протеинов B клеточных рецепторов, mb1 и B29. Аминокислотные последовательности этих протеинов представлены на фиг. 16 /CD3 дельта, SEQ ID N0:24/, фиг. 17 /T3 гамма, SEQ ID N0:25/, фиг. 18 /mb1, SEQ ID N0: 26/ и фиг. 19 /B29, SEQ ID N0: 27/. Участки последовательностей, достаточные для трансдукции цитолитического сигнала /и поэтому, предпочтительно, включенные в химерический рецептор настоящего изобретения/, представлены в рамках. Химерические рецепторы, которые включают эти протеиновые домены, сконструированы и использованы в способе лечения настоящего изобретения, как описано ранее. Пример XI Экспериментальные методы Инфицирование вакциной и радиоиммуноосаждение Приблизительно 5 ![]() ![]() ![]() ![]() T Клеточную линию WH3 человека, CD8+, CD4– HLA B44 рестриктированную цитолитическую линию выдерживали в IMDM, 10% сыворотке человека со 100U/мл IL-2, и периодически стимулировали либо неспецифически, облученными /1000 рад/ HLA несовместимыми лимфоцитами периферической крови и 1 мкг/мл фитогемагглютинина, либо специфически, облученными B44-содержащими моноядерными клетками. Спустя один день неспецифической стимуляции, PHA разбавляют до 0,5 мкг/мл, добавляя свежую среду, и спустя три дня среду меняют. Клетки выращивают в течение, по крайней мере, 10 дней с последующей стимуляцией перед использованием в анализе на цитотоксичность. Клетки инфицируют рекомбинантной вакциной при умножении инфекции, по крайней мере, 10, в течение одного часа в не содержащей сыворотки среде, с последующим инкубированием в полной среде в течение трех часов. Клетки собирают центрифугированием и повторно суспендируют при плотности 1 ![]() Для создания точечных мутаций в аминокислотных остатках 11 и/или 15Z последовательности, были получены синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от BamHI сайта в обратном направлении от Z трансмембранного домена, и превращающие нативный Z остаток 11 от Cys в Gly /C11G/ или остаток 15 от Asp в Gly /D15G/ или оба /C11G /D15G/, и используют в PCR реакциях для создания мутированных фрагментов, которые снова вставлены в дикого типа CD4: Z конструкции. Для создания Z делеций, Z ДНК последовательности амплифицируют PCR, используя синтетические олигонуклеотидные праймеры, сконструированные для создания стоп кодона /UAG/ после остатка 50, 59 или 65. Праймеры, содержащие сайты расщепления для энзима Notl, вырезают 5 или 6 остатков с 5′ конца, обычно в последовательности CGC GGG CGG CCG CTA /SEQ ID N0: 11/, где последние три остатка соответствуют стоп антикодону. За последовательностями Notl и стоп антикодона следуют 18 или более остатков, комплементарных целевому 3′ концу фрагмента. Полученные химеры обозначены CD16:Z V51*, CD16:Z E60* и CD16:Z D66*, соответственно. BamHI сайт в обратном направлении от трансмембранного домена и Notl сайт используют для создания фрагментов, которые заново вводят в дикого типа CD16:Z конструкцию. Мономерные Z химеры создают, высвобождая Z трансмембранную и мембранную проксимальную внутриклеточные последовательности перевариванием BamHI и Sacl Asp– и Cys– CD4:Z конструкцию, описанную ранее, и включая фрагмент в CD16:Z E60* и CD16:Z D66* конструкции соответственно. CD16: 7:Z /48-65/ и CD16:7:Z /48-59/ химерические конструкции, состоящие из трех частей. Для получения конструкции CD16:Z D66*, Z кДНК последовательность, соответствующую трансмембранному домену, и последующих остатков цитоплазмического домена заменяют соответствующими трансмембранным и цитоплазмическим доменом, полученными из CD5 и CD7 кДНК. Фрагменты CD5 и CD7 создают в PCR реакции, используя форвардные олигонуклеотиды, включающие BamHI рестрикционный сайт расщепления и соответствующие участку непосредственно перед трансмембранным доменом CD5 и CD7, соответственно, с последующим обратным олигонуклеотидным перекрыванием CD5 и CD7 последовательностей, соответственно, и Z последовательности, которая содержит Sacl рестрикционный сайт расщепления. CD5: Z: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG /SEQ ID N0: 12/ CD7: Z: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTC GTT TGG CGC CGA ATT CTT ATC CCG /SEQ ID N0: 13/. CD5 и CD7 PCR продукты были переварены BamHI и Sacl и лигированы с BamHI и Sacl переваренными CD16:Z E60*, и заменяют Z последовательность из BamHI до Sacl фрагментом CD7. Для создания конструкций CD16:CD5 и CD16:CD17, фрагменты CD5 и CD7 были получены с помощью PCR, используя олигонуклеотиды, содержащие Notl рестрикционный сайт расщепления и кодирующий стоп кодон /UAA/ после остатка Gln416 и Ala193 CD5 и CD7, соответственно, CD5 и CD7 PCR фрагменты были переварены BamHI и Notl и включены в CD16:Z Asp66* конструкцию. In vitro мутагенез N-терминальных остатков с Z цитолитическим сигнальным фрагментом трансдукции Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от Sacl сайта внутрь Z фрагмента и превращающие нативный остаток 48 из Asn в Ser /48S/, остаток 50 из Leu в Ser /LS 50S/, и остаток 51 из Туг в Phe /V52F/ были синтезированы и использованы в PCR реакции для создания фрагментов, которые снова включили в дикого типа CD16:7:Z /48-65/ конструкцию. In vitro мутагенез C-терминальных остатков с Z цитолитическим сигнальным фрагментом трансдукции Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от Notl сайта 3′ до стоп кодона и превращающие нативный остаток 60 из Glu в Gln /E60Q/, остаток 61 от Glu в Gln /E61Q/, остаток 62 из Tyr в Phe /V62F или V62S/, и остаток 63 из Asp в An /D63N/ были синтезированы и использованы для создания фрагментов, которые были субклонированы в дикого типа CD16:Z D66* конструкцию от BamHI сайта до Notl сайта. CD16: 7: Z /33-65/, CD16:7:Z /71-104/, CD16:7:Z /104-137/ химерические конструкции CD7 трансмембранный фрагмент, содержащий Mlul и Notl сайты по соединению между трансмембранным и внутриклеточным доменами, был получен в результате PCR с использованием олигонуклеотида со следующей последовательностью: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA /SEQ ID N0: 14/. Полученный PCR фрагмент был переварен BamHI и Notl и снова включен в CD16:7:Z /48-65/ конструкцию. Z фрагменты, кодирующие остатки 33-65, 71-104 и 104-137, получают в результате реакции PCR, с использованием пар драйверов, содержащих Mlul сайты у 5′ конца форвардных праймеров и стоп кодоны с последующими Notl сайтами у 5′ конца обратных праймеров. В каждом случае рестрикционные сайты были включены на шесть остатков от 5′ конца праймера для обеспечения расщепления рестрикционным энзимом. S33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID N0: 15), S71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ IS N0: 16); S104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID N0: 17). Конструирование FcR 11A делеционных мутантов Карбоксильные терминальные FcR 11A делеционные мутанты были сконструированы в результате PCR таким же способом, как и для полной длины конструкций, превращая последовательности, кодирующие тирозин, в положении 282 и 298 в стоп кодоны /TAA/. N-терминальные делеции были созданы за счет амплификации фрагментов, кодирующих последовательно без внутриклеточного домена за счет PCR, с использованием олигонуклеотидов, которые позволяют включать полученные фрагменты между Mlul и Notl рестрикционными сайтами в ранее сконструированные плазмиды экспрессии, кодирующие CD16 внеклеточный домен, слитый с CD7 трансмембранным доменом, причем последний оканчивается в Mlul сайте и соединяет трансмембранный и внутриклеточный домены. Другие варианты Описанные ранее примеры демонстрируют тот факт, что аггрегации Z, ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() (2) Информация для последовательности N 1: (i) Характеристики последовательности: (A) длина: 1728 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) тип цепей: двойная (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: ДНК (геномная) (iii) Описание последовательности: SEQ ID N0: 1: Формула изобретения
![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||