Патент на изобретение №2160992

(54) СУХОЙ БИОПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и смежных отраслях. Сухой препарат содержит в качестве бактерий смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и H-1 при следующем соотношении ингредиентов на 1 г препарата: смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и H-1 2-100 млрд. клеток; желатин 0,5-2,5 мас. %, сахароза 5-20 мас.%, обезжиренное сухое молоко 3-5 мас.%, вода 2-8 мас.%, остатки культуральной жидкости остальное. Способ получения препарата включает культивирование бактерий с использованием посевного материала штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и H-1 на гидролизатно-молочной питательной среде. Питательная среда содержит дополнительно 0,3-0,5% углекислого кальция. После культивирования в культуральную жидкость вводят защитную среду при следующем соотношении компонентов: 1-3 мас.% желатина, 8-12 мас. % сахарозы и 3-5 мас.% обезжиренного сухого молока. Смесь замораживают при – 25-30°С. Затем подвергают сублимационной сушке при температуре не выше – 30°С и давлении 13-15 Па. Полученный препарат показал высокую сбраживающую активность в отношении молока и стабильность при длительном хранении. Способ позволяет получать заданное соотношение клеток различных штаммов в кисломолочном продукте. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к сухим препаратам и способам их получения и может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и смежных отраслях.

Известны сухие биопрепараты на основе молочнокислых микроорганизмов (Евр. пат. N 0097484, 1984 кл. A 23 C 1/05: евр. пат. N 0043962, 1980 кл. A 23 C 19/086: пат. США N 4289888, 1979, кл. A 23 C 9/123). Препарат содержит клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Технология включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

Известны способы получения сухих препаратов на основе ацидофильных микроорганизмов (пат. РФ N 2064269, 1994, кл. A 23 C 9/12, авт.св. СССР N 1227145, 1983, кл. A 23 C 9/123), включающие в себя выращивание микроорганизмов на питательной среде, введение в культуральную жидкость (КЖ) или ее концентрат защитной среды и сушку. Препарат, как правило, содержит клетки бактерий и остатки КЖ с некоторыми добавками, улучшающими его эксплуатационные характеристики.

Недостатком препаратов является относительно невысокая активность, а для способов – невозможность использовать для получения препаратов на основе симбиотических бактериальных систем.

Прототипом настоящего изобретения является препарат и способ его получения, описанный в патенте RU 2080795 A 1, 10.06.1997. Данный препарат содержит живые клетки Lactobacillus acidophilus, желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, воду, остатки культуральной жидкости.

Способ его получения предусматривает культивирование бактерий Lactobacillus acidophilus в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, замораживание при температуре – 30 – (-)35^oC в течение 18-12 часов, сублимационную сушку в течение 45-52 часов.

Недостатком прототипа является неприменимость способа для получения сухого препарата на основе симбиотических бактериальных культур.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание более эффективного и стабильного при хранении ферментирующего молоко препарата на основе симбиотических штаммов Lactobacillus acidophilus и способа его получения.

Основной проблемой являлось обеспечение устойчивого равновесия между штаммами как в полученном конечном продукте при его хранении, так и на стадиях получения препарата, в ходе которых клетки подвергаются стрессовым воздействиям, т. е. нахождение таких условий, при которых воздействие на оба штамма являлось бы одинаковым и обеспечивало бы оптимальное поддержание баланса в системе.

Было найдено, что предъявляемым требованиям отвечал препарат следующего состава (содержание ингредиентов на 1 г сухого препарата):
Смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и H-1 – 2-100 млрд. клеток
Желатин – 0,5-2,5 мас.%
Сахароза – 5-20 мас.%
Обезжиренное сухое молоко (ОСМ) – 3-5 мас.%
Вода – 2-8 мас.%
Остатки культуральной жидкости (ОКЖ) – Остальное
Отличием препарата от прототипа использование в качестве бактерий смеси штаммов Lactobacilfus acidophilus А-1 и H-1, а в качестве источников углерода и азота – смесь желатина, сахарозы и обезжиренного сухого молока определенного состава.

Состав препарата является оптимальным для данных штаммов. Оптимальным является соотношение их клеток 1: 1, однако допустимо соотношение клеток штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 до 40:60 до 60:40.

Содержание сахарозы менее 5% ведет к неудовлетворительной структуре конечного препарата, при ее содержание более 20% – препарат инактивируется.

Содержание желатина менее 0.5% требует ведения высушивания при более низких температурах, что сложно технологически, содержание желатина более 2.5% приводит к возникновению дисбаланса штаммов, что снижает сбраживающие характеристики конечного препарата.

Содержание обезжиренного молока менее 3% ведет к инактивации препарата, его содержание более 5% приводит к возникновению дисбаланса штаммов, что снижает сбраживающие характеристики конечного препарата.

Содержание воды должно быть минимальным для длительного хранения, однако сушка до содержания воды менее 2% технологически более сложна, причем низкое содержание воды негативно сказывается на поддержание клеток в живом виде.

Способ получения сухого препарата заключается в том, что культивирование проводят с использованием посевного материала штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 на гидролизатно-молочной питательной среде, содержащей дополнительно 0.3-0.5% углекислого кальция, после культивирования в культуральную жидкость в качестве добавок вводят (% в расчете на получаемый сухой продукт) 1-3 мас.% желатина, 8-12 мас.% сахарозы и 3-5 мас.% обезжиренного сухого молока и подвергают замораживанию при -25 -30^oC, а затем сублимационной сушке при температуре не выше – 30^oC и давлении 13-15 Па. Сушку проводят, как правило, в течении по крайней мере 40 часов.

Оптимально, чтобы соотношение клеток штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 в посевном материале составляло около 1:1, что контролируется по данным оптической плотности исходных культур при длине волны 600 нм.

В качестве гидролизатно-молочной питательной среды используют стандартную среду, содержащую в 1 л панкреатического гидролизата молока 2 г пептона, 0.6 г хлористого натрия, 0.02 г цистеина, и 1 г лактозы с учетом погрешности введения компонентов (около 5%). Как правило, культивирование проводят при 382^oC в течение 16-20 часов.

Возможное даже небольшое изменение условий получения препарата приводит либо к ухудшению его активности, либо к снижению срока хранения.

Сущность изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. В ампулы с лиофилизованными эталонами производственных штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 вносят по 1 мл дистиллированной воды, после чего тщательно перемешивают и вносят раздельно в пробирки с обезжиренным молоком, и выдерживают при 372^oC в течение 16-20 часов
Посевной материал вводят в колбы, содержащие по 100 мл гидролизатно-молочной среды, содержащей в панкреатическом гидролизате молока 0.2 г пептона, 0.06 г хлористого натрия, 0.002 г цистеина и 0.1 г лактозы и выдерживают при 372^oC в течение 16-20 часов.

Готовый посевной материал получают смешением отдельно выращенных культур таким образом, чтобы соотношение клеток отдельных штаммов было близко к 1:1 по данным оптической плотности при длине, волны 600 нм.

Выращивание нативной культуры производится на среде, содержащей в 1 л панкреатического гидролизата молока 2 г пептона, 0.6 г хлористого натрия, 0.02 г цистеина, 4 г углекислого кальция и 1 г лактозы при 382^oC в течение 16-20 часов.

К культуральной жидкости добавляют 3-компонентную среду, состоящую из сахарозы, желатина и ОСМ в соотношении 10% : 2% : 4% в расчете на сухое вещество конечного продукта.

Полученный продукт разливают по пенициллиновым флаконам исходя из 2 мл препарата в каждом флаконе и замораживают в камере сублимационной установки при -25-30^oC, после чего подвергают сублимационному высушиванию при температуре конденсатора-вымораживателя не выше -50^oC и вакууме 13-15 Па. Время достижения рабочего вакуума составляет 20-30 мин, суммарная длительность процесса высушивания – 40-46 часов.

Полученный после высушивания препарат имеет вид однородной по цвету и высоте таблетки. Цвет от светлого до темно-бежевого. Время полного растворения таблетки в дистиллированной воде от 0.5 до 2 мин. Остаточная влажность, как правило около 31%. (возможно до 5%).

Результаты испытаний по хранению препарата и сквашиванию молока по сравнению с жидкой формой приведены в таблице 1.

Пример 2. В условиях примера 1 осуществлялось получения препарата с модификацией отдельных компонентов его состава. Полученные результаты испытаний приведены в таблице 2.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой стабильности и эффективности заявляемого препарата.

Формула изобретения

1. Сухой препарат бактерий Lactobacillus acidophilus, содержащий живые клетки бактерий, желатин, сахарозу, обезжиренное сухое молоко, воду, остатки культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве клеток Lactobacillus acidophilus он содержит смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 при следующем соотношении ингредиентов на 1 г препарата:
Смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 – 2 – 100 млрд клеток
Желатин – 0,5 – 2,5 масс.%
Сахароза – 5 – 20 масс.%
Обезжиренное сухое молоко – 3 – 5 масс.%
Вода – 2 – 8 масс.%
Остатки культуральной жидкости – Остальное
2. Сухой препарат по п.1, отличающийся тем, что соотношение клеток штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 составляет от 40 : 60 до 60 : 40.

3. Способ получения сухого препарата бактерий Lactobacillus acidophilus, включающий в себя культивирование бактерий в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу, обезжиренное сухое молоко и воду, замораживание, сублимационную сушку и получение готовой формы, отличающийся тем, что культивирование проводят с использованием посевного материала штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 на гидролизатно-молочной питательной среде, содержащей дополнительно 0,3 – 0,5% углекислого кальция, после культивирования в культуральную жидкость вводят защитную среду при следующем соотношении компонентов: 1 – 3 мас.% желатина, 8 – 12 мас.% сахарозы и 3 – 5 мас.% обезжиренного сухого молока и подвергают замораживанию при температуре – 25 – 30^oС, а затем сублимационной сушке при температуре не выше – 30^oС и давлении 13 – 15 Па.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что соотношение клеток штаммов Lactobacillus acidophilus А-1 и Н-1 в посевном материале составляет около 1 : 1.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролизатно-молочной питательной среды используют среду, содержащую в 1 л панкреатического гидролизата молока 2 г пептона, 0,6 г хлористого натрия, 0,02 г цистеина и 1 г лактозы.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование проводят при 38 2^oС в течение 16 – 20 ч.

РИСУНКИ

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Вербицкая Наталья Борисовна, Добролеж Ольга Васильевна, Кобатов Алексей Иванович, Петров Леонид Николаевич

Вид лицензии*: ИЛ

Лицензиат(ы): ОАО “Севзапмолоко”

Номер и год публикации бюллетеня: 12-2004

Договор № 18804 зарегистрирован 19.03.2004

Извещение опубликовано: 27.04.2004

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Петров Леонид Николаевич

(73) Патентообладатель:

Вербицкая Наталья Борисовна

(73) Патентообладатель:

Добролеж Ольга Васильевна

(73) Патентообладатель:

Кобатов Алексей Иванович

(73) Патентообладатель:

ООО “Производственно-коммерческий центр “ЭПИДБИОМЕД СПб”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 12.10.2005 № РД0002921

Извещение опубликовано: 20.12.2005 БИ: 35/2005

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Производственно-коммерческий центр “ЭПИДБИОМЕД СПб”

Вид лицензии*: ИЛ

Лицензиат(ы): Федеральное государственное унитарное предприятие “Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов ФМБА России”

Договор № РД0032074 зарегистрирован 31.01.2008

Извещение опубликовано: 10.03.2008 БИ: 07/2008

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия