Патент на изобретение №2329828

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ, ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Группа изобретений относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии. Способ изготовления вакцины включает культивирование штамма B.necrophorum «0-1» ВИЭВ на питательной среде, инактивирование формалином, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, отделение центрифугата и концентрирование экзотоксина ультрафильтрацией до содержания белка 5,5-6,0 мг/мл (по Лоури). Получают экзотоксин B.necrophorum с молекулярной массой 18000-20000 Д. Добавляют к нему раствор формалина до конечной концентрации 0,4%. Инактивируют в течение 15 суток и смешивают инактивированный формалином экзотоксин с масляным адъювантом при следующем содержании компонентов (в мас.%): инактивированный формалином экзотоксин B.necrophorum – 60,0-67,0, масляный адювант – 33,0-40,0. Затем гомогенизируют полученную суспензию и расфасовывают готовую вакцину. Вакцину животным вводят внутрикожно одно-, двукратно в дозе 0,2-0,4 мл. Изобретение позволяет упростить способ изготовления высокоэффективной вакцины, получить вакцину с низкой реактогенностью, а также снизить прививочную дозу вакцины и повысить удобство ее введения. 3 н. и 7 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии и может быть использовано для профилактики и лечения некробактериоза животных.

Известен способ изготовления вакцины для профилактики и лечения некробактериоза, включающий выделение из местного очага эпизоотической культуры возбудителя некробактериоза, его выращивание, инактивацию, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, извлечение антигена из биомассы путем последовательного трехкратного замораживания-оттаивания клеток и их гомогенизации с последующим центрифугированием и выделением из супернатанта протективного антигена, представляющего собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин, и параллельно – выделение экзотоксина осаждением желатином, объединение полученных антигенов в соотношении 1:3, повторное добавление инактиватора формалина и соединение с масляно-ланолиновым адъювантом в соотношении 1:1. Получают вакцину следующего состава: цитоплазматическая фракция, содержащая эндо- и экзотоксин, взятые в соотношении 1:3 – 450-550 мл, формалин – 3,5-5,0 мл, минеральное масло – 381-497 мл, ланолин – до 1 л. Вакцину водят подкожно однократно, в дозе 1-2 мл (см., например, RU 2043773 C1, 20.09.1995).

Известный способ предусматривает предварительный подбор местных штаммов для каждого конкретного хозяйства, что невозможно при промышленном производстве. Кроме того, нетехнологичны стадии разделения бактериальной суспензии и концентрирования экзотоксина, а также подкожный метод введения вакцины является очень трудоемким.

Известен способ изготовления вакцины для профилактики и лечения некробактериоза, включающий использование штамма B.necrophorum ВИЭВ, селекционированного по признаку максимальной иммуногенности и антигенной активности, после культивирования которого отделяют биомассу от культуральной жидкости центрифугированием, отделенную биомассу ресуспендируют в физиологическом растворе и из полученной суспензии извлекают эндотоксин многократным замораживанием и оттаиванием до полного разрушения бактериальных клеток и отделением от клеточного дейтрита центрифугированием, а из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, затем смешивают полученные эндотоксин и экзотоксин в равных объемных соотношениях и добавляют адъювант на основе минерального масла и ланолина. Полученную вакцину вводят подкожно двукратно в дозе 2 мл, а затем в дозе 3 мл (см., например, RU 2109519 C1, 27.04.1998).

Известный способ изготовления вакцины также нетехнологичен и трудоемок, а двукратное подкожное введение вакцины также трудоемко и приводит к образованию гранулем на месте введения.

Известен способ изготовления вакцины для профилактики и лечения некробактериоза, включающий использование модифицированного штамма F.necrophorum, после культивирования которого выделяют экзотоксин, причем получают три вида экзотоксина: «инактивированный» (с добавлением формалина), «сырой» и «полуочищенный», которые и используют в качестве вакцины (см., например, US 5455034 А, 03.10.1995). Вакцину также вводят подкожно двукратно в дозе 4,6-20 мл.

Известный способ очень длителен и трудоемок, используемые дозы вакцины очень высоки.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего получить высокоиммуногенную безвредную вакцину, которую можно вводить животным внутрикожно, и при этом снизить дозу вводимого препарата.

Поставленная задача решается за счет того, что способ изготовления вакцины для профилактики и лечения некробактериоза включает культивирование штамма B.necrophorum «0-1» ВИЭВ на питательной среде, инактивирование формалином, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, отделение центрифугата и концентрированно экзотоксина ультрафильтрацией до содержания белка 5,5-6,0 мг/мл (по Лоури), получение экзотоксина с молекулярной массой 18000-20000 Д, добавление раствора формалина до конечной концентрации 0,4%, инактивирование полученного экзотоксина B.necrophorum в течение 15 суток, смешивание инактивированного формалином экзотоксина с масляным адъювантом при следующем содержании компонентов (в мас.%):

гомогенизацию полученной суспензии и расфасовку готовой вакцины.

Поставленная задача решается также за счет того, что в процессе культивирования B.necrophorum через питательную среду периодически пропускают очищенный азот, концентрирование экзотоксина осуществляют на ультрафильтрационной установке с полыми волокнами, имеющими размер пор 1,5 кДа, а после смешивания инактивированного формалином экзотоксина B.necrophorum с масляным адъювантом гомогенизацию полученной суспензии осуществляют на коллоидной мельнице.

Поставленная задача решается и за счет того, что изготовленная по изложенному выше способу вакцина содержит (в мас.%):

Целесообразно в качестве масляного адъюванта использовать легкое минеральное масло или минеральное масло БГМ-6М.

Поставленная задача решается также за счет того, что полученную вакцину вводят животным одно-, двукратно внутрикожно в дозе 0,2-0,4 мл.

Целесообразно вводить вакцину с помощью безигольного инъектора. В качестве безигольного инъектора целесообразно использовать инъектор БИ-7 или БИ-7М.

Целесообразно для профилактики и лечения крупного рогатого скота в неблагополучном по некробактериозу хозяйстве вводить вакцину двукратно с интервалом 4-6 недель, а затем однократно через каждые 6 месяцев в дозе 0,4 мл.

Целесообразно для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота вводить вакцину совместно с гипериммунной сывороткой.

Для профилактики и лечения некробактериоза оленей целесообразно вводить вакцину внутрикожно однократно в дозе 0,2 мл.

Техническим результатом заявленного изобретения является упрощение способа изготовления высокоэффективной вакцины с низкой реактогенностью, а также снижение прививочной дозы вакцины при повышении удобства ее введения.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Штамм B.necrophorum «0-1» ВИЭВ культивируют на среде Китт-Тароцци в бутылях в течение 2-х суток при температуре 37°С, затем пересевают во флаконы с той же средой. Выращенную матровую расплодку засевают в биореактор с предварительно простерилизованной питательной средой, изготовленной на основе перевара Хоттингера, и культивируют в течение 24-36 часов при 37°С. В процессе культивирования через среду периодически пропускают очищенный азот. По окончании выращивания культуру проверяют на чистоту и оптическую концентрацию. Инактивируют формалином до конечной концентрации 0,4%. Выросшую инактивированную культуру разделяют на биомассу и культуральную жидкость центрифугированием. Из культуральной жидкости выделяют и концентрируют экзотоксин на ультра-фильтрационной установке с полыми волокнами, имеющими размер пор 1,5 кДа, до содержания белка 6,0 мг/мл (по Лоури), затем добавляют формалин до конечной концентрации 0,4% и выдерживают при 42°С в течение 15 суток. Получают экзотоксин с молекулярной массой 18000-20000 Д. Для изготовления вакцины полученный инактивированный экзотоксин смешивают с масляным адъювантом при следующем соотношении компонентов (в мас.%): инактивированный экзотоксин – 60,0-67,0, масляный адъювант – 33,0-40,0. После чего вакцину гомогенизируют на коллоидной мельнице и расфасовывают. В качестве масляного адъюванта используют легкое минеральное масло или минеральное масло БГМ-6М.

Пример 2.

Вакцину, полученную по примеру 1 и имеющую следующий состав (в мас.%) инактивированный экзотоксин – 65,0, масляный адъювант (легкое минеральное масло) – 35,0, используют в неблагополучном по некробактериозу хозяйстве для профилактики и лечения крупного рогатого скота.

Вакцину вводят двукратно с интервалом 5 недель, затем однократно через каждые 6 мес. в дозе 0,4 мл внутрикожно при помощи безыгольного инъектора БИ-7. Всего было вакцинировано около 100 тысяч больного и условно здорового скота в 25 регионах Российской Федерации.

Эффективность вакцины составила 98±0,2%. На месте введения вакцины отсутствовали воспалительные явления. Вакцина создает иммунитет в течение 6 месяцев после вакцинации.

Пример 3.

Для профилактики некробактериоза крупному рогатому скоту вводят гипериммунную сыворотку, а затем вакцину, полученную по примеру 1 и имеющую следующий состав: инактивированный экзотоксин – 63,0 мас.%, масляный адъювант минеральное масло БГМ-6М – 37,0 мас.%. Вакцину вводят двукратно с интервалом 6 недель, а затем однократно через каждые 6 мес в дозе 0,3 мл внутрикожно при помощи безыгольного инъектора БИ-7.

Комиссионная проверка, проведенная в хозяйствах Московской области, показала, что применение вакцины совместно с гипериммунной сывороткой способствует полной ликвидации болезни в течение 1-1,5 лет.

Пример 4.

Полученную по примеру 1 вакцину и имеющую следующий состав: инактивированный экзотоксин – 60,0 мас.%, масляный адъювант (легкое минеральное масло) – 40,0 мас.% применяют для профилактики и лечения некробактериоза северных оленей. Широкое производственное испытание вакцины было проведено в оленеводческих хозяйствах республики Саха (Якутия). Было вакцинировано около 110 тыс. оленей, заболеваемость которых после вакцинации составила 1±0,4%. Вакцину вводили однократно внутрикожно при помощи безигольного инъектора БИ-7М в дозе 0,2 мл.

Испытания показали, что вакцина высокоиммуногенна, безвредна, предохраняет от заболевания некробактериозом 98-99% привитых оленей и создает иммунитет продолжительностью 6 месяцев.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет упростить способ изготовления высокоэффективной вакцины против некробактериоза животных, получить вакцину с низкой реактогенностью, а также снизить прививочную дозу вакцины и повысить удобство ее введения.

Формула изобретения

1. Способ изготовления вакцины для профилактики и лечения некробактериоза животных, включающий культивирование штамма B.necrophorum «0-1» ВИЭВ на питательной среде, инактивирование формалином, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, отделение центрифугата и концентрирование экзотоксина ультрафильтрацией до содержания белка 5,5-6,0 мг/мл (по Лоури), получение экзотоксина B.necrophorum с молекулярной массой 18000-20000 Д, добавление раствора формалина до конечной концентрации 0,4%, инактивирование полученного экзотоксина в течение 15 сут, смешивание инактивированного формалином экзотоксина с масляным адъювантом при следующем содержании компонентов, мас.%: инактивированный формалином экзотоксин B.necrophorum – 60,0-67,0; масляный адъювант 33,0-40,0, гомогенизацию полученной суспензии и расфасовку готовой вакцины.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования B.necrophorum через питательную среду периодически пропускают очищенный азот, концентрирование экзотоксина осуществляют на ультрафильтрационной установке с полыми волокнами, имеющими размер пор 1,5 КДа, а после смешивания инактивированного формалином экзотоксина B.necrophorum с масляным адъювантом гомогенизацию полученной суспензии осуществляют на коллоидной мельнице.

3. Вакцина для профилактики и лечения некробактериоза животных, изготовленная по способу по п.1, содержащая, мас.%: инактивированный формалином экзотоксин B.necrophorum – 60,0-67,0; масляный адъювант 33,0-40,0.

4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что в качестве масляного адъюванта содержит легкое минеральное масло или минеральное масло БГМ-6М.

5. Способ профилактики и лечения некробактериоза животных, включающий введение вакцины, отличающийся тем, что животным вводят внутрикожно вакцину по любому из пп.3 и 4 одно- двукратно в дозе 0,2-0,4 мл.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что вакцину вводят с помощью безигольного инъектора.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве безигольного инъектора используют инъектор БИ-7 или БИ-7М.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что для профилактики и лечения крупного рогатого скота в неблагополучном по некробактериозу хозяйстве вакцину вводят внутрикожно в дозе 0,4 мл двукратно с интервалом 4-6 нед, а затем однократно через каждые 6 мес.

9. Способ по п.5, отличающийся тем, что для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота вакцину вводят совместно с гипериммунной сывороткой.

10. Способ по п.5, отличающийся тем, что для профилактики и лечения некробактериоза оленей вакцину вводят внутрикожно однократно в дозе 0,2 мл.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Мельник Николай Васильевич

(73) Патентообладатель:

Караваев Юрий Владимирович

Договор № РД0043500 зарегистрирован 19.11.2008

Извещение опубликовано: 27.12.2008 БИ: 36/2008

TK4A – Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”

Напечатано: (73) Караваев Юрий Владимирович (RU)

Следует читать: (73) Караваев Юрий Дмитриевич (RU)

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2008

Код раздела: PC4A

Извещение опубликовано: 20.02.2009 БИ: 05/2009