Патент на изобретение №2329506

(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СЕКРЕТОРНЫХ АНТИТЕЛ К F-1 АНТИГЕНУ ПРИ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВОИЕРСИНИОЗНЫМ ИММУНОГЕННЫМ ПРЕПАРАТОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и иммунологии. О наличии секреторных антител у иммунизированных животных судят по определению в копрофильтратах антител к F1-антигену в реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного сухого. Использование способа позволяет обнаруживать секреторные антитела в копрофильтратах вакцинированных иммуногенным препаратом экспериментальных животных и оценивать напряженность гуморального иммунного ответа.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”Secretory Immunoglobulin A Response to Yersinia Species. J Clin Microbiol., 1988 Feb; 26 (2):287-92, PMID: 3277996, реф., [он-лайн], [найдено 26.11.2007], найдено из базы данных PubMed. DENCHEV V et al. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol., 1988, 32 (4), 457-65, PMID: 3065408, реф., [он-лайн], [найдено 26.11.2007], найдено из базы данных PubMed.

Изобретение относится к области микробиологии и иммунологии и может быть использовано при изучении ответной реакции экспериментальных животных и людей, вакцинированных иммуногенным препаратом, защищающим от патогенных иерсиний.

Изучение иммуногенных свойств нового вакцинного штамма на морских свинках показало, что при подкожной и пероральной иммунизации обеспечивается защита не менее 80% животных при последующем заражении патогенными иерсиниями.

Бактерии вакцинного штамма EV линии НИИЭГ чумного микроба в соответствующих опытах не защищали иммунизированных морских свинок от инфицирования культурами возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза несмотря на то, что серологическими методами антитела к F1-антигену у морских свинок, выработанные в процессе иммунизации, определялись. Специфичность развития у иммунизированных морских свинок псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза была подтверждена выделением чистых культур соответствующих возбудителей из внутренних органов погибших животных.

В настоящее время разработана технология получения иммуногенного препарата на основе штамма Y.pseudotuberculosis 172 и проведены его экспериментально-лабораторные испытания.

Ввиду того, что при псевдотуберкулезе и кишечном иерсиниозе ведущим является алиментарный путь заражения, необходимо было в эксперименте установить, вырабатываются ли антитела в ответ на иммунизацию животных иммуногенным препаратом, и если вырабатываются, то появляются ли они на поверхности слизистой оболочки кишечника (так называемые фекальные или секреторные антитела). Как известно, слизистая оболочка кишечника является эффективной системой сигнализации, охватывающей весь организм. Продуцируемый секреторный иммуноглобулин A (s-IgA) активно транспортируется в иммунном организме через эпителий слизистой оболочки и оказывает защитный эффект (Gizurarson S., Sigurdoardottir M., Stanzeit В. Selective augmentation of antibodies in various mucosal regions after intranasal immunization with diphtheria in mice. – J. Pharm. Sci. – 1988. – Vol.87, № 11. – P 1267-1269).

Поскольку бактериальные клетки вакцинного штамма псевдотуберкулезного микроба – У. pseudotuberculosis 172, на основе которого получен иммуногенный препарат, синтезируют F1-антиген чумного микроба, о наличии иммунного ответа у экспериментальных животных можно судить, определяя антитела к F1-антигену в копрофильтратах. При вакцинации против чумы животных или людей чумной живой вакциной на основе штамма EV линии НИИЭГ секреторные антитела в копрофильтратах не определяют, а выявляют антитела против F1-антигена в крови вакцинируемых и судят о напряженности иммунитета (Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В.Наумова, Л.В.Самойловой. – Саратов: Изд-во ГосНИПЧИ “Микроб”, 1992. – 278 с.; Домарадский И.В. Чума. – M.: Медицина, 1998. – 176 с; Hill J., Williamson E.D., Titball R.W. Vaccine against Yersinia comprising one or two antibodies, one specific for Yersinia pestis Fl-antigen and the other one for Yersinia pestis V-antigen. – Международная заявка на изобретение WO 2004019980 от 03.11.2004). Аналогичным образом определяют антитела против F1-антигена в крови у лиц, переболевших чумой (постинфекционный иммунитет).

Ввиду того, что иммуногенный препарат на основе штамма Y.pseudo-tuberculosis 172 создан впервые и его аналогов не существует, важно иметь в арсенале средств контроля за развитием поствакцинального иммунитета у людей простой в исполнении и надежный способ определения секреторных антител. В этом случае разработанный способ определения секреторных антител в копрофильтратах иммунизированных людей позволит иметь ежедневно информацию о нарастании титров специфических антител против F1-антигена и в последующем сопоставлять их с титром антител против того же F1-антигена в сыворотке крови.

⁷ живых микробов на мышь в объеме 0,1 мл физиологического раствора. Ежедневно от каждой мыши отдельно отбирали фекалии, которые анализировали на наличие IgA-антител методом иммуноферментного анализа и экскрецию бактерий Y.enterocolitica серовара ОЗ биотипа ОЗ. Авторами было установлено, что к 21 дню после первой иммунизации уровень специфических IgA-антител резко возрастал и оставался высоким в течение 10 дней, а потом снижался. Заражение мышей на 32 день после первой иммунизации живой культурой Y.enterocolitica приводил к некоторому подъему титра IgA-антител. Обнаруженные фекальные антитела ингибировали колонизацию Y.enterocolitica в кишечнике вакцинированных мышей.

При заражении животных контрольной группы авторы в первые 2 недели обнаруживали незначительное выведение из организма бактерий Y.enterocolitica и отсутствие, или очень низкие титры IgA-антител. К 20 дню наблюдались резкий подъем уровня секреторных IgA-антител и одновременно активная экскреция бактерий Y.enterocolitica (до 1-10 на 1 г фекалий). Анализ полученных данных позволил авторам выявить различия поствакцинального и постинфекционного иммунитета при кишечном иерсиниозе.

Описанный метод определения фекальных антител класса иммуноглобулинов A (IgA) позволяет выявлять антитела против бактерий того штамма Y.enterocolitica, которым иммунизировали мышей и которым впоследствии инфицировали животных. Однако тест-система, реализующая потенциальные возможности описанного метода, не определяет антитела класса иммуноглобулинов против гетерологичных штаммов иерсиний, в частности, против F1-антигена рекомбинантного штамма У. pseudotuberculosis 172, составляющего основу иммуногенного препарата.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего обнаруживать секреторные антитела в копрофильтратах вакцинированных иммуногенным препаратом экспериментальных животных. Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого способа, заключается в том, что у вакцинированных иммуногенным препаратом экспериментальных животных, а в последующем – у людей, можно в динамике изучать нарастание титров специфических антител против F1-антигена и судить о состоянии поствакцинального противоиерсиниозного иммунитета. Поставленная задача достигается тем, что антитела к F1-антигену определяются в копрофильтрате у каждого вакцинированного иммуногенным препаратом животного в реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного сухого (Инструкция по применению диагностикума эритроцитарного чумного иммуноглобулинового сухого и жидкого. Diagnosticum erythrocytarum pesticum immunoglobulinum siccum et fluidum / Комитет Госсанэпиднадзора Российской Федерации. – Утв. 25.07.1995 г.). Согласно Инструкции… диагностикум дает положительную реакцию непрямой гемагглютинации с агглютинирующей сывороткой, прилагаемой в комплект ингредиентов, в разведении 1:200000 для реакции макрометодом. Аналогичное определение проводится с образцами копрофильтратов животных контрольной группы, которым в одинаковые с опытными животными сроки вводится подкожно стерильный изотонический раствор хлористого натрия.

Методически определение секреторных антител проводится следующим образом. Во флакон с 1 г фекалий животного вносится 2,0 мл изотонического раствора хлористого натрия. Содержимое флакона перемешивается до гомогенного состояния, после чего во флакон добавляется еще 3,0 мл изотонического раствора хлористого натрия. Флакон закрывается пробкой, интенсивно встряхивается и оставляется на 30 мин при комнатной температуре для оседания плотных частиц. Спустя указанный промежуток времени из флакона пипеткой отбираются 0,5 мл надосадочной жидкости и переносятся в пробирку с 4,5 мл изотонического раствора хлористого натрия. Содержимое пробирки тщательно перемешивается и используется для определения титра секреторных (фекальных) антител против F1-антигена.

Для определения титров секреторных антител используют полистироловые пластины с лунками. В 7 лунок пластины, исключая первую, вносят 0,4 мл раствора твина-80 в разведении 1:50 000. В первую лунку вносят 0,4 мл суспензии из пробирки, приготовленной как указано выше и включающей определенный объем надосадочной жидкости из тестируемой пробы фекалий. Во вторую лунку с 0,4 мл раствора твина-80 также вносят 0,4 мл суспензии из той же пробирки, из которой аналогичный объем суспензии был внесен в первую лунку. После перемешивания суспензии во второй лунке отбирают 0,4 мл и переносят в третью лунку. Делая таким образом двукратные разведения исследуемой суспензии путем переноса 0,4 мл разведенной суспензии из одной лунки в другую, завершают процесс разведения на седьмой лунке, из которой 0,4 мл смеси суспензии удаляют. Восьмая лунка используется для контроля диагностикума. Во все восемь лунок добавляется 0,05 мл диагностикума эритроцитарного чумного антигенного 2,5%-ной концентрации. Содержимое лунок перемешивают покачиванием полистироловой пластины. Пластину оставляют на 2…2,5 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Результат считается положительным, когда эритроциты выпали на дно лунок равномерным слоем, занимая не менее 2/3 сферической поверхности лунок. При отрицательном результате реакции непрямой гемагглютинации эритроциты выпадают на дно лунки в виде “пуговки” или узкого колечка с ровным краем, как в контроле (восьмая лунка). За титр специфических секреторных антител в исследуемой суспензии принимается то ее максимальное разведение, при котором еще регистрируется положительный результат.

Титр секреторных (фекальных) антител определяется у каждого животного опытной и контрольной групп отдельно, а затем полученные результаты обсчитываются согласно руководству (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. – 180 с.).

Экспериментально установлено, что в фекалиях животных контрольной группы специфических секреторных антител против F1-антигена обнаружить не удалось. Как в первой, так и в последующих лунках эритроциты диагностикума выпадают на дно лунок в виде узкого колечка с ровным краем (отрицательный результат в РНГА).

В опытной группе животных, вакцинированных иммуногенным препаратом, в первые 4 дня после вакцинации секреторные (фекальные) антитела против F1-антигена также не определялись.

Появление антител против F1-антигена было зарегистрировано на 5 сутки после иммунизации животных опытной группы. На дне лунок определялся хорошо выраженный равномерный слой выпавших в осадок эритроцитов диагностикума в виде “перевернутого зонтика”. Уровень специфических антител против F1-антигена нарастает к 18…20 дню после иммунизации (титр антител 1:160…1:320), а затем, несколько снижаясь, остается довольно высоким в течение 30 дней (срок наблюдения).

Экспериментальные данные, полученные при пероральной вакцинации иммуногенным препаратом морских свинок, свидетельствуют о формировании у животных надежной защиты от возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза именно при пероральном инфицировании. Очевидно, что вырабатываемые в организме животных секреторные антитела, в том числе против F1-антигена, выделяются слизистой оболочкой кишечника и ингибируют колонизацию патогенных иерсиний, внося тем самым существенный вклад в поствакцинальный иммунитет.

Заявляемый способ позволяет избежать нескольких трудоемких этапов исследования, связанных с ежедневным взятием крови, приготовлением сыворотки, которые на 24 ч отодвигают постановку реакции непрямой гемагглютинации для определения специфических антител против F1-антигена.

Формула изобретения

Способ обнаружения секреторных антител к F1-антигену при вакцинации противоиерсиниозным иммуногенным препаратом, включающий иммунизацию животных, ежедневный отбор фекалий и подготовку на изотоническом растворе хлорида натрия копрофильтратов животных опытной и контрольной групп, отличающийся тем, что о наличии секреторных антител судят по определению в копрофильтратах антител к F1-антигену в реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного сухого.