Патент на изобретение №2329303

(54) МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ НУКЛЕОКАПСИДА (КОР) ВИРУСА ГЕПАТИТА С-4G5, СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВГС-ИНФЕКЦИИ И КОМБИНАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается диагностики гепатита С. Сущность изобретения заключается в создании моноклональных антител, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С – 4G5, и разработке способа диагностики на основе сэндвич-варианта иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида (кор-белка) вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, направленных к линейным и к конформационно-зависимым эпитопам кор-белка: МКА 1F9 – к линейному эпитопу с аминокислотными остатками (а.о.) 81-85, МКА 27 и 4G5 – к конформационно-зависимым эпитопам на участке 1-150 а.о. кор-белка. При этом комбинация моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С, может быть использована как для захвата (захватывающие антитела), так и для детекции (детектирующие антитела) кор-белка. Разработанный сэндвич-вариант иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител, включающей МКА 4G5, обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять кор-белок в крови как у бессимптомных ВГС-инфицированных доноров, так и у больных острым и хроническим гепатитом С. Способ позволяет диагностировать с большой вероятностью гепатит С на ранних стадиях заболевания и эффективен для детекции ВГС по крайней мере трех генотипов, наиболее актуальных для России. Преимущества количественного определения кор-белка могут быть полезны для определения вирусной нагрузки при интерферонотерапии. 3 н.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается диагностики гепатита С с помощью сэндвич-варианта иммуноферментного количественного анализа на основе специфически реагирующей с кор-белком вируса гепатита С (ВГС) комбинации моноклональных антител, включающей моноклональные антитела 4G5, продуцируемые штаммами гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus.

Специфическая диагностика вирусного гепатита С является актуальной проблемой медицины. Преимущественным методом первичной рутинной диагностики вирусного гепатита С в настоящее время является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на детекции антител к вирусным белкам. Однако одного этого теста недостаточно, поскольку специфические антитела не выявляются на ранних стадиях после инфицирования вирусом в так называемую фазу серонегативного «окна», имеющую продолжительность до нескольких месяцев, а также при иммунодефицитных состояниях. Прецизионная детекция вируса гепатита С и мониторинг подтвержденного гепатита С требуют определения прямых маркеров ВГС: РНК и вирусспецифических белков. Для количественного выявления РНК ВГС в плазме крови, и том числе и для количественной оценки, в настоящее время используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который обладает высокой чувствительностью, однако его широкое применение в практическом здравоохранении ограничено. В последние годы активно разрабатываются иммуноферментные методы выявления белка нуклеокапсида (кор-белка) ВГС в сыворотках крови, способные служить определенной альтернативой ПЦР. За рубежом предложено несколько коммерческих тест-систем для детекции кор-белка ВГС в сыворотках крови, однако в нашей стране они дороги и малодоступны. Отечественные тест-системы для выявления кор-белка ВГС отсутствуют.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в создании моноклональных антител, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С – 4G5, и разработке способа диагностики на основе сэндвич-варианта иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида (кор-белка) вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, направленных к линейным и к конформационно-зависимым эпитопам кор-белка. При этом комбинация моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С, используется как для захвата (захватывающие антитела), так и для детекции (детектирующие антитела) кор-белка.

К существенным признакам изобретения, совпадающими с признаками прототипа, относятся следующие.

1. Моноклональные антитела, входящие в состав сэндвича, получены методом гибридомной технологии при иммунизации мышей BALB/c рекомбинантными белками нуклеокапсида ВГС и специфически взаимодействуют с белком нуклеокапсида ВГС. В определенной комбинации они в составе сэндвич-варианта иммуноферментного анализа выявляют белок нуклеокапсида в сыворотках ВГС-позитивных лиц.

2. «Захватывающие» (capture) моноклональные антитела сорбируются (наносятся) в лунки 96-луночных планшетов из полистирола или других полимерных материалов, обладающих высокой сорбционной способностью.

3. Контактирование адсорбированных на твердой фазе МКА с образцами сыворотки или плазмы крови, в результате чего при положительном взаимодействии формируется комплекс антиген-антитело.

4. Выявление комплекса моноклональных антител с кор-антигеном известными иммунологическими методами, например иммуноферментным, радиоизотопным, хемилюминесцентным и т.п. Это осуществляется посредством нанесения детектирующих моноклональных антител к кор-белку, меченных ферментом, радиоизотопом и т.п.

5. Выявление кор-белка является количественным методом. Концентрацию кор-белка в образцах сывороток оценивают по калибровочной кривой с рекомбинантным кор-белком.

К существенным признакам изобретения, отличающихся от признаков прототипа, можно отнести следующие.

2. Данная комбинация МКА используется как в качестве «захватывающих» антител, так и детектирующих в виде меченных ферментом конъюгатов, в то время как в составе вышеуказанных тест-систем «захватывающие» и детектирующие МКА направлены к разным эпитопам кор-белка.

Штамм 4G5, продуцирующий моноклональные антитела, реагирующие с кор-белком ВГС, получен гибридизацией культивируемых клеток миеломы мыши sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных рекомбинантным кор-белком ВГС с последовательностью 1-150 а.о., соответствующим генотипу (субтипу) 1b. Гибридные клетки культивируют на селективной среде ГАТ, выявляют клоны, продуцирующие моноклональные антитела к кор-белку ВГС. Путем серийных пассажей клетки наиболее продуктивного клона 4G5 выводят в массовую культуру. Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus 4G5 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 8/1/1 и характеризуется следующими признаками:

1. Морфологические свойства: культура клеток 4G5 состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами.

2. Культуральные свойства: в качестве ростовой среды для культивирования использовали среду RPMI-1640, содержащую 15-20% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ед/мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина. Характер роста – стационарная суспензия, метод снятия – встряхивание. Частота пассирования – 2-3 суток. Посевная доза 200 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева – 1:2-1:3. Введение клеток штамма в концентрации 10⁷/мл в брюшную полость мышей, предварительно сенсибилизированных за 10-14 суток инъекцией 0,3-0,5 мл пристана, вызывает у них через 10-16 суток образование асцитных опухолей.

3. Криоконсервирование гибридомы. За 24 часа до замораживания гибридому пересевают 1:2. Осажденные центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ЭТС, 10% ДМСО) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл по 1-1,8 мл. Хранят 24 часа при -70С°, затем переносят в жидкий азот.

4. Характеристика иммуноглобулинов. Продуцируемые гибридомой МКА относятся к классу IgG, субкласс – IgG1.

В качестве образцов антител используют культуральную жидкость, образующуюся при культивировании гибридомы, или асцитную жидкость.

Пример 1. Активность и специфичность моноклональных антител определяли в твердофазном варианте иммуноферментного анализа. На твердую фазу сорбировали рекомбинантный кор-белок 1-150 а.о. в концентрации 1 мкг/мл, а также синтетические пептиды различной протяженности (от 12 до 40 а.о.), перекрывающие последовательность кор-белка, в концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5, в течение ночи при комнатной температуре. Затем отмывали лунки планшетов (PBS+0,1% твин-20) и наслаивали культуральные жидкости или асцитные жидкости клона 4G5 в серийных 5-кратных разведениях в блокировочном растворе (1% казеин в PBS-твин-20) и инкубировали 1 час при 37°С. После отмывки наносили козьи антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой (DAKO, Дания). Выявление ферментативной активности связавшейся пероксидазы проводили с использованием субстрата тетраметилбензидина (ТМБ). Измеряли оптическую плотность (ОП) образцов в двухволновом режиме – при длине волны 450 нм (измерение) и 620 нм (референс). За титр МКА принимали последнее разведение, ОП которого превышала ОП отрицательного контроля (МКА к неструктурным белкам ВГС) в 2,5 раза.

С рекомбинантным белком 1-150 а.о. культуральная жидкость клона 4G5 взаимодействует с титром 1:256-1:512, асцитная жидкость – с титром 1:10⁷

В изобретении разработан способ диагностики гепатита С с помощью сэндвич-варианта ИФА с использованием комбинации моноклональных антител, направленных к разным эпитопам кор-белка ВГС.

Пример 2. Экспериментальная проверка способности 7 оригинальных МКА к кор-белку в различных сочетаниях выявлять кор-белок в образцах плазм крови ВГС-позитивных доноров крови.

Антигенную активность кор-белка определяли с помощью сэндвич-варианта ИФА в образцах плазм доноров крови, среди которых 17 образцов содержали антитела к ВГС и РНК ВГС, 20 образцов не содержали этих маркеров (отрицательный контроль). РНК ВГС определяли методом полимеразной цепной реакции (ПНР), наличие и спектр антител к белкам ВГС выявляли с использованием скринирующих и подтверждающих тест-наборов фирмы “Диагностические системы” (г.Нижний Новгород).

Подготовка проб для анализа кор-белка. К образцам плазмы добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) 4000 (“Serva”, Германия) до конечной концентрации ПЭГ 4%. Осадок формировался в течение ночи или не менее 3 ч при 4°С, затем смесь центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (PBS) таким образом, чтобы конечный объем составил 1/15 часть исходного объема образца плазмы. Затем к образцам добавляли твин-80 до конечной концентрации 0,5% с целью удаления липидной оболочки вирионов и поверхностных белков.

МКА к кор-белку сорбировали в лунки 96-луночных панелей Nunc Maxisorp (Дания) в концентрации 5 мкг/мл (50 мкл) в растворе PBS в течение ночи при комнатной температуре, отмывали (PBS+0,1% твин-20) и блокировали неспецифические участки связывания 5% обезжиренным сухим молоком на PBS в течение часа при 37°С. Затем наносили подготовленные образцы (50 мкл) и инкубировали 2 ч при 37°С при постоянном встряхивании. Одновременно вносили разведения положительного контроля – рекомбинантного кор-белка. После отмывки на 1 ч (37°С) добавляли конъюгаты – МКА к core-белку, меченные пероксидазой хрена, в блокировочном растворе (1% казеин в PBS-твин-20). Выявление ферментативной активности связавшейся пероксидазы проводили с использованием субстрата тетраметилбензидина (ТМБ). Измеряли оптическую плотность (ОП) образцов в двухволновом режиме – при длине волны 450 нм (измерение) и 620 нм (референс). Пробы считали положительными, если их ОП превышала критическую. Последнюю вычисляли, как среднюю ОП отрицательных контролей (плазмы доноров, не содержащие анти-ВГС) плюс две величины стандартного отклонения. Количество кор-белка в образцах оценивали по калибровочной кривой с рекомбинантным кор-белком, для которого показана линейная зависимость ОП от концентрации в диапазоне 0,1-15 нг/мл.

Исследования образцов в ИФА показали, что из 25 вариантов различных сочетаний испытуемых моноклональных антител самой высокой чувствительностью обладают комбинации, составленные из МКА 27, 1F9, 4G5 и 6D1 (таблица 1). Сравнительный анализ показал, что комбинация МКА 27, 1F9 и 4G5 (в равных соотношениях) при сорбции на твердую фазу и в виде конъюгатов более эффективно выявляет кор-белок в большинстве образцов, которые дали отрицательные результаты при использовании индивидуальных МКА. Так, применение комбинации данных МКА позволило достичь чувствительности 88% и выявить кор-белок в 15 из 17 исследованных образцов. Например, по сравнению с вариантом МКА 27-27 кор-белок был дополнительно обнаружен в 3 образцах, еще в 3 была значительно повышена интенсивность положительного сигнала. Чувствительность выявления рекомбинантного кор-белка была 300 пг/мл, что в пересчете на исходный объем плазмы с учетом 15-кратного концентрирования составило 20 пг/мл. Отсутствие кор-белка в 2 образцах при наличии РНК ВГС может свидетельствовать о низкой концентрации вируса в крови. Плазмы ВГС-негативных доноров не обнаружили неспецифических взаимодействий с МКА 27,1F9 и 4G5 (специфичность – 100%).

Пример 3. Выявление кор-белка ВГС в образцах сывороток и плазм лиц, инфицированных ВГС различных генотипов.

Известно, что ВГС обладает высокой генетической изменчивостью. В России наиболее распространены генотипы 1 (субтип 1b) и 3 (субтип 3а), реже встречается ВГС генотипа 2. Оригинальные МКА были получены при иммунизации мышей рекомбинантными белками, синтезированными в соответствии с аминокислотной последовательностью кор-белка генотипа 1b. Важно было выяснить возможность использования разработанного способа диагностики гепатита С для выявления ВГС разных генотипов.

Исследовали сыворотки и плазмы крови от 57 ВГС-позитивных лиц, среди которых были больные с острым и хроническим гепатитом С (ОГС и ХГС) и инфицированные доноры крови. Генотипирование образцов проводили с помощью ПЦР с использованием праймеров из участка кор-белка. Подготовку образцов и проведение ИФА осуществляли по методикам, описанным в примере 2. В сэндвиче использовали комбинацию МКА 27, 1F9 и 4G5.

Пример 4. Использование разработанного способа для диагностики ранних стадий острого гепатита С.

При инфицировании вирусом гепатита С характерна длительная (продолжительностью до нескольких месяцев) фаза серонегативного «окна»; в этот период можно выявить только прямые маркеры ВГС – РНК и вирусспецифические белки. Цель работы – выявление кор-белка ВГС у пациентов с острым гепатитом в серонегативный период.

Исследовали образцы сывороток от 4 больных с симптомами острого гепатита (желтуха, гепатоспленомегалия, повышение аланинаминотрансферазы (АЛТ) более чем в 10 раз по сравнению с нормой). При первичном скрининге сывороток антитела к ВГС, маркеры других вирусных гепатитов, а также иные этиологические причины не обнаружены, в связи с чем этим больным был постановлен диагноз острого гепатита неясной этиологии. Далее проводили динамическое наблюдение за этими больными.

Подготовку образцов и сэндвич-ИФА выполняли, как описано в примере 2, использовали комбинацию МКА 27, 1F9 и 4G5. РНК определяли с помощью ПЦР. Наличие и спектр антител к белкам ВГС выявляли с использованием скринирующих и подтверждающих тест-наборов фирмы “Диагностические системы” (г.Нижний Новгород).

У 2 пациентов (№1 и №2) при отсутствии анти-ВГС антител были выявлены как кор-белок, так и РНК ВГС (таблица 3). Таким образом, этим больным был поставлен диагноз острого гепатита С. В дальнейшем у этих пациентов диагноз был подтвержден – отмечена сероконверсия ВГС. У 2 пациентов (№3 и №4) в образцах не определялись ни кор-белок, ни РНК ВГС; при динамическом наблюдении данных пациентов также не обнаружен ни один из маркеров гепатита С, в связи с чем диагноз острого гепатита неясной этиологии остался без изменений.

Таким образом, разработанный сэндвич-вариант иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител, включающей МКА 4G5, обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять кор-белок в крови как у бессимптомных ВГС-инфицированных доноров, так и у больных острым и хроническим гепатитом С. Показано достоверное совпадение (р<0,05) результатов определения кор-белка данным способом и РНК ВГС методом ПЦР. Предлагаемый способ позволяет диагностировать с большой вероятностью гепатит С уже на ранних стадиях заболевания, а именно: в тот период, когда еще не выявляются специфические антитела, и эффективен для детекции ВГС по крайней мере трех генотипов, наиболее актуальных для России. Преимущества количественного определения кор-белка могут быть полезны для определения вирусной нагрузки при интерферонотерапии. Внедрение метода в практику позволит увеличить надежность диагностики гепатита С и вирусную безопасность гемотрансфузий.

Формула изобретения

1. Моноклональное антитело 4G5, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus 4G5, депонированным в коллекции перевиваемых клеточных культур ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 8/1/1, иммунореактивное с белком нуклеокапсида (кор-белком) вируса гепатита С (ВГС) и специфичное к конформационно-зависимой антигенной детерминанте на участке 1-150 аминокислотных остатков кор-белка ВГС.

2. Способ диагностики ВГС-инфекции, включающий выявление кор-белка вируса гепатита С в сэндвич-варианте иммуноферментного количественного анализа путем использования комбинации моноклональных антител, иммунореактивных с кор-белком вируса гепатита С, отличающийся тем, что используемые в комбинации моноклональные антитела 27, 1F9 и 4G5 направлены к линейным и к конформационно-зависимым эпитопам (антигенным детерминантам) кор-белка ВГС: МКА 1F9 – к линейному эпитопу с аминокислотными остатками (а.о.) 81-85, МКА 27 и 4G5 – к конформационно-зависимым эпитопам на участке 1-150 а.о. кор-белка.

3. Комбинация моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С, используемая для захвата и детекции кор-белка при осуществлении способа по п.2.