|
|
(21), (22) Заявка: 2006138626/15, 01.11.2006
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
01.11.2006
(46) Опубликовано: 10.07.2008
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
Адрес для переписки:
142132, Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы, ВНИИ животноводства
|
(72) Автор(ы):
Кленовицкий Павел Михайлович (RU),
Волкова Наталья Александровна (RU),
Волкова Людмила Александровна (RU),
Зиновьева Наталия Анатольевна (RU)
(73) Патентообладатель(и):
Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ) (RU)
|
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биологии, в частности к цитогенетике сельскохозяйственной птицы. Способ включает отбор проб крови и культивирование ее с митогеном, в качестве которого используют 0,1% раствор конканавалина А (СоА) в дозе 20 мкг митогена на 1 мл культуры лимфоцитов. Изобретение обеспечивает удешевление способа и повышение выхода митотических клеток. 1 табл., 2 ил.
(56) (продолжение):
CLASS=”b560m”хромосом птиц / Методические рекомендации «Исследование хромосом сельскохозяйственных животных». – Л., 1976, с.47-56.
Изобретение относится к биологии, в частности к цитогенетике сельскохозяйственной птицы.
Известен способ получения препаратов хромосом птицы из культуры эмбриональных фибробластов [Трофимова Л.В. Особенности получения препаратов хромосом птиц / Методические рекомендации «Исследование хромосом сельскохозяйственных животных» – Л., 1976, с.47-56]. Колхицин вводят в полученную культуру эмбриональных фибробластов птицы. Недостатком данного метода является необходимость забоя птицы, а также потребность в дорогостоящем оборудовании для культивирования клеток.
Задача изобретения – удешевление способа и повышение выхода митотических клеток, пригодных для анализа.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ получения митотических препаратов хромосом птицы, включающий инкубацию лимфоцитов с митогеном, особенностью которого является то, что в качестве стимулятора клеточных делений используют 0,1% раствор конканавалина А (СоА) в дозе 20 мкг митогена на 1 мл культуры лимфоцитов.
Пример. Взятие крови у птицы осуществляют из крыльевой вены с помощью стерильного одноразового шприца, смоченного гепарином. Ввиду того, что эритроциты птиц содержат ядра, которые создают сильный митотически инертный фон, в значительной мере затрудняющий поиск метафаз, для постановки культуры используют не цельную кровь, а плазму с лейкоцитами. Для получения плазмы кровь выдерживают 2-3 часа в холодильнике при 4°С, либо в случае необходимости кровь центрифугируют при 500-700 об/мин в течение 10 минут.
Плазму с лейкоцитами в количестве 2 мл помещают в стерильные пластиковые флаконы, содержащие 8 мл среды RPMI 1640 или RPMI 1640Т, добавляют 0,1% раствор конканавалина А в концентрации 20 мкг/мл. Культивирование лимфоцитов осуществляют в термостате при температуре 38°С в течение 71 часа. На 68 часу культивирования в культуру вводят колхицин из расчета 0,3 мкг/мл.
По окончании культивирования содержимое флаконов переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 100 g. После чего надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 10 мл гипотонического раствора (0,52% KCl) и инкубируют 40 мин при 38°С. После удаления гипотонического раствора центрифугированием в принятом режиме к осадку добавляют 3 мл свежеприготовленного, охлажденного фиксатора Лилли (метанол – ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Фиксируют при 4°С не менее 45 мин, за это время фиксатор трижды меняют, старый фиксатор удаляют центрифугированием.
После последней фиксации клеточную взвесь наносят на чистые, обезжиренные стекла и оценивают качество препарата под микроскопом при увеличении 20х. Изменяя объем фиксатора, доводят концентрацию клеток до оптимума. Для приготовления основных препаратов хромосом клеточную взвесь по 12-14 капель наносят на стекла и высушивают препараты на воздухе.
Готовые цитологические препараты окрашивают 2-4% раствором красителя Романовского-Гимза или по одной из существующих прописей для дифференциальных окрасок и исследуют под световым микроскопом, анализируя хромосомы на стадии метафазы.
Метафазы домашней курицы, полученные по предлагаемому способу, представлены на фиг. 1.
У кур достоверно идентифицируются 5 пар макрохромосом и до 6 – субмикрохромосом. Первая, вторая и четвертая пары у них субметацентрические, третья, шестая, седьмая и одиннадцатая – акроцентрики, восьмая, девятая и десятая метацентрического типа, половая Z хромосома – метацентрик (фиг. 2).
По стимулирующему действию на клетки крови птицы конканавалин А (СоА) значительно превосходит известный способ с ФГА-П.
Сопоставление митотической активности данных лектинов приведено в таблице.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать препараты хромосом сельскохозяйственной птицы для цитогенетического анализа и имеет следующие преимущества: высокий выход митотических клеток, пригодных для анализа, уменьшенные затраты на митоген.
Таблица
Влияние различных митогенов на стимуляцию деления лимфоцитов птицы |
| Вид птицы |
Митотическая активность лектинов, % РБТЛ |
| ФГА-П (фитогемагглютинин 20 мкг/мл) |
СоА (конканавалин А 20 мкг/мл) |
| Курица (Gallus gallus) |
0 |
++ |
| Мускусная утка (Cairina moscata) |
± |
++ |
| Гусь (Anser anser) |
0 |
++ |
| Примечание: 0 – митотическая активность отсутствует; ± – единичные митозы в отдельных культурах; ++ – нормальная митотическая активность. |
Изобретение применимо в биологии, в частности в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся цитогенетикой сельскохозяйственной птицы.
Формула изобретения
Способ получения препаратов метафазных хромосом сельскохозяйственной птицы, включающий отбор проб крови и культивирование ее с митогеном, отличающийся тем, что в качестве митогена используют 0,1%-ный раствор конканавалина А (СоА) в дозе 20 мкг митогена на 1 мл культуры лимфоцитов.
РИСУНКИ
|
|
