Патент на изобретение №2328531
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕЛЕЙ T30N, S52G, I199V И R200Q ГЕНА PRKAG3
(57) Реферат:
Изобретение относится к молекулярной генетике. Предложен способ определения полиморфизма гена – маркера мясной продуктивности свиней PRKAG3. Изобретение применимо в молекулярной генетике для диагностики аллелей с целью использования их в селекции животных. 5 ил.
Изобретение относится к молекулярной генетике, в частности к способам определения полиморфизма генов – маркеров мясной продуктивности свиней.
Задача изобретения заключалась в расширении арсенала способов диагностики мутаций T30N, S52G, I199V и R200Q гена PRKAG3 для определения генотипов животных по данному гену, снижении трудоемкости и временных затрат предлагаемого способа. Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики аллелей T30N, S52G, I199V и R200Q гена PRKAG3, включающий амплификацию двух фрагментов – фрагмента 1 гена PRKAG3 длиной 270 п.о., включающего часть экзона 1 и содержащего специфические мутации в позиции 30 и 52 аминокислотной последовательности, и фрагмента 2 гена PRKAG3 длиной 118 п.о., включающего часть экзона 3 и специфические точковые мутации в позиции 199 и 200 аминокислотной последовательности, с использованием биотинилированных реверсивных праймеров: 270 F (позиции 8242 до 8266) AGCTTCCTAGAGCAAGGAGAGAGCC 270 R bio (позиции 8321 до 8342) ACTGGCTGCATGATGTTATGTGC 264 F (позиция 8196 до 8218) ATTCACCCTCAACTGTTCTCTCC 264 R bio (позиция 8376 до 8396) TCACCCACGAAGCTCTGCTTC Особенностью которого является то, что последующее генотипирование продуктов реакции проводят посредством пиросеквенирования с использованием генетических зондов: 30 Seq (позиция 69 до 85) AAGCCATGGGGACCAGG 52 Seq (позиция 135 до 150) GCCTCCGGGCCCGAGG 199/200 Seq (позиция 1831 до 1843) TGGTGGCCAACGG зондов 30 Seq и 52 Seq в мультиплексной системе генотипирования для фрагмента 1 и зонда 199/200 Seq в симплексной системе анализа для фрагмента 2. Нами были подобраны две пары специфических праймеров и 3 секвенирующих зонда (генный банк №АF214521, www.ncbi.nlm.nih.gov) фиг.1: 270 F (позиции 8242 до 8266) AGCTTCCTAGAGCAAGGAGAGAGCC 270 R bio (позиции 8321 до 8342) ACTGGCTGCATGATGTTATGTGC 264 F (позиция 8196 до 8218) ATTCACCCTCAACTGTTCTCTCC 264 R bio (позиция 8376 до 8396) TCACCCACGAAGCTCTGCTTC 30 Seq (позиция 69 до 85) AAGCCATGGGGACCAGG 52 Seq (позиция 135 до 150) GCCTCCGGGCCCGAGG 199/200 Seq (позиция 1831 до 1843) TGGTGGCCAACGG Теоретические выкладки определения полиморфизма гена PRKAG3 в позициях T30N, S52G и I199V, R200Q методом пиросеквенирования в виде гистограмм представлены на фиг.2 и 3. Пример. Контрольное использование предложенного способа для идентификации генотипов гена PRKAG3 было проведено на 100 свиньях пород йоркшир, ландрас и дюрок («Троснянский бекона. Орловская обл.). ДНК выделяли из ткани методом Кавасаки по ранее опубликованной методике (Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998, 47 с.). 1. ПЦР1 и ПЦР2 проводили в конечном объеме 40 мкл с использованием праймеров 270 F и 270 R Bio в ПЦР1 и 264 F и 264 R Bio в ПЦР2 в количестве по 10 пкмоль каждого в стандартном температурно-временном режиме. 2. В продукты ПЦР1 и ПЦР2 вносили секвенирующие зонды 30 Seq 52 Seq и 199/200seq и проводили денатурацию в течение 2 мин при 90°С. 3. Проводили пиросеквенирование денатурированных ПНР-продуктов на PSQ 96 МА. 4. Генетические профили полиморфизма гена PRKAG3 в виде результирующих пирограмм представлены на фиг.4 и 5. Таким образом, предложенный способ позволил осуществить одновременную диагностику аллелей T30N, S52G, I199V и R200Q гена PRKAG3 и определить соответствующие генотипы животных. При этом обеспечивалось сокращение затрат времени на выполнение генотипирования. Если при использовании ПЦР-ПДРФ-анализа требуется 12 часов, то пост-ПЦР-анализ-96 проб в предлагаемом нами способе диагностики длится 14 мин, пробоподготовка занимает 20 мин. Изобретение применимо в молекулярной генетике животных для диагностики аллелей T30N, S52G, I199V и R200Q и определения генотипов гена PRKAG3 с целью последующего использования результатов в популяционной генетике, разведении и селекции свиней.
Формула изобретения
Способ диагностики аллелей T30N, S52G, I199V и R200Q гена PRKAG3, включающий амплификацию двух фрагментов гена-фрагмента 1 гена PRKAG3 длиной 270 п.о., включающего часть экзона 1 и содержащего специфические мутации в позиции 30 и 52 аминокислотной последовательности, и фрагмента 2 гена PRKAG3 длиной 118 п.о., включающего часть экзона 3 и специфические точковые мутации в позиции 199 и 200 аминокислотной последовательности, с использованием биотинилированных реверсивных праймеров 270F (позиции 8242 до 8266)AGCTTCCTAGAGCAAGGAGAGAGCC 270R bio (позиции 8321 до 8342) ACTGGCTGCATGATGTTATGTGC 264F (позиция 8196 до 8218)ATTCACCCTCAACTGTTCTCTCC 264R bio (позиция 8376 до 8396) TCACCCACGAAGCTCTGCTTC отличающийся тем, что последующее генотипирование продуктов реакции проводят посредством пиросеквенирования с использованием генетических зондов: 30 Seq (позиция 69 до 85)AAGCCATGGGGACCAGG 52 Seq (позиция 135 до 150)GCCTCCGGGCCCGAGG 199/200 Seq (позиция 181 до 1843)TGGTGGCCAACGG зондов 30 Seq и 52 Seq в мультиплексной системе генотипирования для фрагмента 1 и зонда 199/200 Seq в симплексной системе анализа для фрагмента 2.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
GCC) и в позиции 194 (TTG
