Патент на изобретение №2328526

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарной и медицинской микробиологии. Способ выявления микобактерий предусматривает подготовку диагностического материала. Подготовленный диагностический материал засевают на плотную питательную среду, представляющую собой смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла. Инкубируют микобактерий в термостате. После инкубации осуществляют регистрацию результатов через 24-48-72-96 часов. Изобретение позволяет сократить сроки выявления микобактерий. 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”БИРГЕРА. – М.: Медицина, 1982, с.417-420. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./Под ред. М.О. БИРГЕРА. – М.: Медицина, 1982, с.268-269. RU 2221047 С2, 10.01.2004. RU 2069698 C1, 27.11.1996.

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, а именно к культуральным методам выявления микобактерий комплекса M.tuberculosis, и может быть использовано при проведении противотуберкулезных мероприятий, в научно-исследовательских и производственных лабораториях медицинского и ветеринарного профиля.

Традиционно культуральные исследования диагностического материала осуществляют на плотных яичных и полусинтетических жидких средах, поскольку микобактерии туберкулеза требовательны к составу питательных сред и растут только на специальных, содержащих необходимый набор солей и аминокислот. Это отличает их от ряда других микобактерий, менее требовательных к питательным средам и растущих на стандартном мясопептонном агаре.

Известен культуральный способ выявления микобактерий методом прямого посева, при котором для получения чистых культур микобактерий контаминированный или биоматериал каждой исследуемой пробы после предварительной обработки высевают в 10 пробирок с селективной плотной яичной средой Левенштейна-Йенсена и одновременно по 10 пробирок еще не менее как на две из следующих селективных сред: Гельберга, Петраньяни, Финн-2, Мордовского, Новую, Фаст-3. В процессе инкубации еженедельно регистрируют результаты роста микобактерий (Наставление по диагностике туберкулеза. Утверждено Департаментом ветеринарии, 18 ноября 2002 г., п.6, стр.26-29).

Известный способ выявления микобактерий в чистом виде методом прямого посева на селективные питательные среды из любых биоматериалов ввиду своеобразия их биологических свойств имеет ряд существенных недостатков:

– макроскопический рост микобактерий выявляется чрезвычайно поздно, в сроки от трех недель до трех месяцев;

– накопление биомассы в первой генерации скудное;

– кроме того, при незначительном контаминировании микобактериями исследуемого биоматериала или в случае их ослабленной жизнеспособности видимые невооруженным глазом колонии этих микроорганизмов вообще могут не появиться;

– способы прямого посева на селективные плотные яичные питательные среды недостаточно информативны, трудоемки, малоэффективны, требуют значительных затрат времени и средств.

Задача изобретения – разработка эффективного высокоинформативного способа выявления микобактерий, обеспечивающего сокращение времени диагностики туберкулеза и снижение трудоемкости и материальных затрат на бактериологические исследования.

Технический результат – создание благоприятных условий для жизнедеятельности и эффективного роста микобактерий туберкулеза на питательной среде на основе стандартного мясопептонного агара, снижение продолжительности инкубирования посевов диагностического материала до 4-х суток.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, предусматривающем подготовку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, в качестве питательной среды используют смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла при следующем соотношении компонентов, мас.%: мясопептонный агар – 95%, вазелиновое масло – 5%, а регистрацию результатов осуществляют через 24-48-72-96 часов.

Сущность изобретения заключается в том, что вазелиновое масло (С₅Н₁₂ – С₁₆Н₂₄) обогащает стандартный мясопетонный агар водородом и углеродом. Обладая сильно выраженными адсорбционными свойствами в отношении микобактерий, масло выступает в роли стимулятора, обеспечивающего необходимое ускорение для значительного сокращения времени их роста. После приготовления и застывания смеси масло оказывается на наружной поверхности питательной среды и в поверхностном слое создаются благоприятные условия для размножения и роста колоний микобактерий, в том числе и за счет аэрации. Выбранное соотношение вазелинового масла (5%) и МПА (95%) в питательной среде установлено экспериментально и является оптимальным для высокой чистоты индикации микобактерий при посевах патологических материалов, увеличения скорости их выделения, роста и накопления биомассы.

Для осуществления способа в качестве питательной среды используют мясопептонный вазелиновый агар, который представляет смесь стандартного мясопептонного агара, содержащего 2-3% агар-агара, ph-7,4-7,6, и стерильного вазелинового масла при соотношении компонентов, мас.%: вазелиновое масло – 5, мясопептонный агар – 95. Для ее приготовления к расплавленному мясопептонному агару (МПА), интенсивно помешивая, добавляют стерильное вазелиновое масло. После тщательного перемешивания и встряхивания смесь разливают в большие бактериологические пробирки и чашки Петри, стерилизуют в автоклаве при 120°С, при 1 атм в течение 30 минут. После стерилизации горячие пробирки с полученной питательной средой раскладывали наклонно под углом 5-6°, а чашки Петри оставляют на ровной поверхности стола, и далее их охлаждают при комнатной температуре. При застывании питательной среды образуется плотная влажная поверхность. На нее вносят по 1 мл суспензии подготовленного диагностического материала, приготовленной на стерильном физиологическом растворе в концентрации 2 млрд. микробных тел/мл по оптическому бактериальному стандарту. Диагностический материал для посевов используют после предварительной обработки, включающей измельчение, тщательное растирание со стерильным песком, обработку 6% раствором серной кислоты (в соотношении 1:4), центрифугирование в течение 15 мин при 3000 об/мин, двойное отмывание осадка стерильным физиологическим раствором и приготовление суспензии путем добавления к отмытому осадку стерильного физиологического раствора (1:4).

Инкубирование проводят в термостате при температуре 37-38°С. Для выявления начального роста микобактерий посевы просматривают через 24-48-72-96 часов. У выделенных первичных культур изучают и описывают:

– сроки обнаружения первичного роста;

– характер роста (отдельные колонии, их скопление, сплошной рост);

– характеристика колонии (величина, форма, поверхность, рельеф, конституция, эмульгируемость, пигментообразование);

– тинкториальные свойства микобактерий в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену.

Для сравнительного изучения специфичности способа он был апробирован. В опыте использовали семь микобактериальных штаммов, полученных из музея ФГУ Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (Mycobacterium tuberculosis №192, Mycobacterium bovis №14, Mycobacterium avium №961-97, Mycobacterium ihtracellularae №13, Mycobacterium scrofulaceum №13-S, Mycobacterium fortuitum №342 и Mycobacterium phlei №6-78); 15 проб биоматериала (средостенные лимфоузлы с типичными для туберкулеза изменениями), отобранные в условиях мясокомбината при убое туберкулинположительного крупного рогатого скота из неблагополучного по туберкулезу хозяйства Воронежской области и 9 проб не стерильной смеси земли и навоза из благополучной по туберкулезу крупного рогатого скота фермы, которые в условиях лаборатории кафедры искусственно контаминировали суспензиями 4-х музейных штаммов микобактерий: М. bovis-14, M.tuberculosis – 192, М. avium – 961-97, М. phlei-6-78. Для чего из каждой пробы готовили навески по 0,5 грамм, в которые параллельно добавляли по 10 мл суспензии, приготовленной на стерильном физиологическом растворе в концентрации 2 млрд. микробных тел/мл по оптическому бактериальному стандарту.

Музейные штаммы микобактерий для получения бактериальной массы выращивали на селективной среде Левенштейна-Йенсена в течение 3-4 недель. Чистоту культуры проверяли визуально и изучением мазков, окрашенных по Циль-Нильсену.

Для выявления первичных культур микобактерий использовали две плотные среды: стандартную, селективную яичную среду Левенштейна-Йенсена и мясопептонный вазелиновый агар (МПВА).

Подготовленные для исследования биоматериалы параллельно высевали на обе питательные среды. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37-38°С в течение 30-45 суток.

Для выявления начального роста микобактерий посевы просматривали каждые сутки и регистрировали результаты.

На мясопептонном вазелиновом агаре появление начального роста патогенных микобактерий – M.tuberculosis, M.bovis:

– в посевах музейных штаммов отмечено через 24-36-48 часов;

– в посевах биоматериалов (от животных и объектов внешней среды животноводческих ферм, искусственно контаминированных данными микобактериями) – через 48-72-96 часа;

Для M.avium – intracellularae, M.phlei – (во всех случаях) через 24-36-48 часов.

Кроме ускоренного роста всех видов микобактерий отмечено обилие колоний на поверхности питательной среды и интенсивное накопление их бактериальной массы.

Результаты исследований представлены в таблице, из которой видно, что скорость и интенсивность роста микобактерий разных видов зависит от способа выделения культуры, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением.

Диапазоны сроков выявления первичных культур и интенсивности их роста в эти сроки существенно отражают различие способов выделения патогенных и непатогенных микобактерий в чистом виде из различных патологических материалов.

Использование предложенного способа выявления микобактерий туберкулеза позволяет значительно сократить сроки проведения диагностических исследований, в весьма короткие сроки получить значительное количество бактериальной массы в первой генерации, что имеет большое значение при изготовлении биопрепаратов (антигенов, аллергенов).

Предложенный способ экспрессен, обладает значительной разрешающей способностью и позволяет эффективно, в кратчайшие сроки, с наименьшими затратами средств и труда получить культуры микобактерий в чистом виде, что создает основу для своевременного и успешного проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий.

Формула изобретения

Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, предусматривающий подготовку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла при следующем соотношении компонентов, мас.%:

а регистрацию результатов осуществляют через 24-48-72-96 ч.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.11.2008

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010