Патент на изобретение №2160779
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ДНК-ЗОНД ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА (BX-ЗОНД)
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для типирования штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности. Предложенный ДНК-зонд BX для типирования штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, является частью рекомбинантной плазмидной ДНК pBX (280 н.п.), которая содержит векторную часть – ДНК pUC19 размером 2600 н.п.; BglII-XbaI – фрагмент ДНК HRSIII/37-зонда, размером 180 н.п.; уникальные сайты рестрикции: AluI и HaeIII и генетический маркер: Lac-оперон, Ap-устойчивость. Предложенный ДНК-зонд позволяет типировать штаммы чумного микроба, выделенные из различных природных очагов. Изобретение относится к биотехнологии, в частности генетической инженерии, и может быть использовано для типирования штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности методом ДНК-ДНК гибридизации с использованием специфического ДНК-зонда. Известен принцип генетического зондирования, который широко используется для изучения различных микроорганизмов, например применение зондов нуклеиновых кислот, позволяющих идентифицировать легко передающиеся линии Pseudomonas cepacia (PCT/US96/11132, C 12 Q 1/68), ряд генетических зондов для идентификации чумного микроба (см. текст ниже) и др. Однако все вышеперечисленные зонды не предназначены для типирования штаммов возбудителя чумы различного происхождения. Наиболее близким к заявляемому зонду является ДНК-зонд, созданный на основе HRS-элементов, а именно ДНК-зонд HRSIII/37, описание которого дано в паспорте депонированного в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского научно-исследовательского противочумного института “Микроб” штамма E. coli HB101pHRSIII/37 – продуцента последнего. Способ получения данного зонда заключается в том, что фрагмент хромосомной ДНК чумного микроба размером около 230 н.п. был лигирован в векторную плазмиду pUC19, которую предварительно обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой BamHI с последующим воздействием S1-нуклеазы для формирования тупых концов. Полученную рекомбинантную плазмиду pHRSIII/37 трансформировали в штамм E.coli HB101, необходимые клоны которой отбирали по способности последних расти на среде с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм E. coli HB101pHRSIII/37 является источником ДНК-зонда HRSIII/37. Задача заявляемого изобретения состоит в расширении группы ДНК-зондов, способных типировать штаммы чумного микроба, выделенные из различных природных очагов, а также получении штамма-продуцента заявляемого ДНК-зонда. Заявляемый ДНК-зонд BX для типирования штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, является частью рекомбинантной плазмидной ДНК pBX (2780 н.п.), которая содержит векторную часть-ДНК pUC19 размером 260 н. п. , BglII-XbaI-фрагмент ДНК HRSIII/37-зонда размером 180 н.п., уникальные сайты рестрикции: AluI и HaeIII и генетический маркер: Lac-оперон, Ap-устойчивость. Предложенный ДНК-зонд BX был получен следующим образом. Сначала была сконструирована рекомбинантная плазмида pBX и получен штамм E. coli HB101pBX-донор заявляемого ДНК-зонда. Для этого на первом этапе проводят выделение ДНК плазмиды pHRSIII/37 из штамма кишечной палочки E. coli HB101pHRSIII/37 и векторной плазмиды pUC19 из штамма E. coli TG1. Клетки штаммов кишечной палочки выращивают на агаре Хоттингера (pH 7,2) с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) при температуре 37oC в течение суток. Плазмидную ДНК из указанных штаммов выделяют, например, методом О. Т. Можарова (Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций, 1982, ч. 1, с. 48-49). Полученные препараты плазмидных ДНК pHRSIII/37 и pUC19 используют до конструирования рекомбинантной плазмиды pBX. На второй этапе клонируют фрагмент ДНК из плазмиды pHRSIII/37 в векторную плазмиду pUC19. Плазмидную ДНК pHRSIII/37 инкубируют с рестриктазами BglII и XbaI при температуре 37oC в течение 3 часов. Продукты гидролиза разделяют под действием электрического тока в 1% агарозном геле. В длинноволновом ультрафиолетовом свете (200 – 350 нм) отмечают положение низкомолекулярного BglII-XbaI-ДНК фрагмента (180 н.п.) с дальнейшим его выделением, например, методом электроэлюции в лунку (Миниатис Т. с соавт., Молекулярное клонирование, М., 1984). Полученный BglII-XbaI-фрагмент лигируют с векторной плазмидой pUC19, предварительно рестрицированной эндонуклеазами BamHI и XbaI, с образованием рекомбинантной плазмиды, обозначенной pBX. Полученный штамм E. coli HB101, содержащий рекомбинантную плазмиду pBX, характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, не образуют спор. Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) и лактозы (10 мкг/мл). На плотной среде образуют серые, гладкие, блестящие, круглые колонии с ровным краем. При выращивании на бульоне образуют ровную интенсивную муть. Физико-биохимические признаки: оптимальная температура роста 37oC, оптимум pH 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота – минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме), органические соединения (пептон, триптон, аминокислоты). Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл. Использование полученного ДНК-зонда BX демонстрируется следующим примером. На втором этапе проводим ДНК-ДНК-гибридизацию нерадиоактивномеченного ДНК-зонда BX с хромосомной ДНК возбудителя чумы согласно рекомендациям фирмы “Boehringer-Mannheim” (Германия). Ферментативный гидролиз хромосомной ДНК штаммов чумного микроба с использованием рестрикционной эндонуклеазы EcoRI производства “Fermentas” (Литва) проводят в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляют в 0,9% агарозном гелях в трис-ацетатной буферной системе (pH 8,0-8,2) на камере “Maxiphor” (“Hoefer”, США) в течение 16 часов. Блотинг ДНК из геля на нейлоновые фильтры “Hуbond N” (“Amersham”, Англия) проводили с помощью прибора “Transvac” (“Haefer”, США). Отжиг блота проводят УФ в течение 1,5-2,0 минут. Формула изобретения
 т
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 08.12.2001
Номер и год публикации бюллетеня: 11-2003
Извещение опубликовано: 20.04.2003
|
||||||||||||||||||||||||||
