Патент на изобретение №2160778

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS СEREUS-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза акриламида из акрилонитрила. Штамм бактерий Bacillus cereus B5 продуцирует нитрилгидратазу на простой органоминеральной среде. Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила 220 ед, акрилонитрила – 200 ед. Нитрилгидратаза штамма В cereus B5 термостабильна, применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратаций акрилонитрила в водных растворах. Штамм обладает более высокой активностью, удовлетворительной термостабильностью и гомогенностью культуры. 5 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, которая может быть использована для получения важных продуктов, в частности, акриламида из акрилонитрила. Нитрилгидратаза – фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот до соответствующих амидов.

Известны микроорганизмы, продуцирующие фермент нитрилгидратазу и относящиеся к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Brevibacterium, Agrobacterium. В том числе известны штаммы, способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Rhodococcus rhodochrous J-1 [1], Rhodococcus sp. N771 [2], Rhodococcus sp. N774 [3], Pseudomonas chlororophis B23 [4], Brevibacterium R312 [5], Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 [7].

Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению является штамм Rhodococcus rhodochrous М8 [6], который используется для синтеза концентрированных водных растворов акриламида из акрилонитрила [8,9].

Недостатком бактерий Rhodococcus является относительно медленный рост и связанные с этим трудности культивирования и поддержания гомогенности культуры в процессе промышленного производства указанного штамма, а также невысокая активность.

Задачей изобретения является быстрорастущий, легко культивируемый штамм с высокой активностью и удовлетворительной термостабильностью нитрилгидратазы. Для решения этой задачи предлагается штамм бактерий Bacillus cereus В5 – продуцент нитрилгидратазы.

Заявляемый бактериальный штамм на основании таксономического изучения отнесен к виду Bacillus cereus. Это первый известный штамм вида Bacillus cereus, обладающий способностью преобразовывать нитрилы в амиды. Данный штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Bacillus cereus В 5 на минеральной среде с ионами кобальта, содержащей в качестве индуктора нитрилы и амиды органических кислот, например, ацетонитрил или ацетамид, а в качестве источника углерода – глюкозу. Все компоненты среды являются коммерчески доступными соединениями, что особенно важно в случае промышленного использования штамма. Важным технологическим преимуществом использования штамма является высокая скорость роста и температурная стабильность фермента. Максимальная активность фермента наблюдается при 55^oC.

Данный микроорганизм отличается быстрым ростом на простой органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы и простотой поддержания гомогенности культуры.

Штамм Bacillus cereus В5 может быть использован в биотехнологическом процессе получения амидов, в частности, акриламида.

Штамм характеризуется следующими культуральными, морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культуральные свойства: при росте на мясопептонном агаре штамм проявляет грибовидный рост, образует бесцветные плоские колонии с ризойдным краем, поверхность матовая. При росте на мясопептонном бульоне образует пленку и осадок.

Морфологические признаки. Клетки грамположительные, подвижные, факультативно анаэробные, палочковидные, размеры 0,9-1,2 х 2,0-5,0 мкм, образуют термоустойчивые эндоспоры.

Физиологические свойства: штамм редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес- Проскауэра положительная. Штамм оксидазокаталазоположительный, уреазоотрицательный. Растет при pH 6-9, оптимальное значение pH 7,2, при температуре 0-45^oC, оптимальное значение температуры 34^oC. Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, не образует кислоты из арабинозы и маннита. Гидролизует крахмал и казеин. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты.

Чувствительность к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к хлорафениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, тетрациклину.

Патогенность: штамм не патогенный.

Изобретение описывает данный микроорганизм для использования в процессе гидратации различных нитрилосоединений и получения соответствующих амидосоединений, включая любой его мутант.

Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий может быть получена на различных видах сред, включающие различные источники углерода и азота, органические и неорганические соли, которые широко используются для получения культуры обычных бактерий.

Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту (мкМ амид/мг сух.вес.мин). Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Bacillus cereus В5.

Заявляемый штамм был выделен из почвы. 1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава (табл. 1).

Культивировали 3 суток при температуре 30^oC и аэрации. 2 мл полученной суспензии вносили в 100 мл той же среды.

Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 24-48 ч при 28-30^oC, отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Bacillus cereus В5, обладающий нитрилгидратазной активностью.

Пример 2. Использование штамма Bacillus cereus В 5 для трансформации ацетонитрила в ацетамид.

Клетки культивировали в среде следующего состава, pH 7,2 (табл. 2).

Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.

Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом.

1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,2. Клетки ресуспендировали в том же буфере до значения оптической плотности 0,2-0,5 (А 540 нм). К 2 мл клеточной суспензии добавляли ацетонитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 20^oC в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н HCl. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.

Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 220 ед.

Пример 3. Использование штамма Bacillus cereus В5 для трансформации акрилонитрила в акриламид.

Штамм Bacillus cereus В5 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл.

Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 200 ед.

Измерение активности в зависимости от времени роста клеток представлено в таблице 3. Очевидно, что штамм Bacillus cereus В 5 обладает более высокой скоростью роста и активностью, чем прототип.

Пример 4. Очистка культуры Bacillus cereus В5 от контаминации.

Полученный штамм Bacillus cereus В 5 культивировали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл, содержащих по 150 мл среды состава, представленного в табл. 4.

При ОП₅₄₀ суспензии 0,1 стерильность среды преднамеренно нарушали внесением 0,5 г почвы. Культивировали в течение 24 ч на ротационной качалке (120 об/мин) при 30^oC. Затем колбу с культурой прогревали при 80^oC в течение 15 мин. После этого продолжали культивирование при тех же условиях в течение 24 ч.

Образцы полученной таким образом культуры рассевали до отдельных колоний на агаризованную среду аналогичного состава и на мясопептонный агар. Во всех вариантах культура была гомогенной.

Пример 5. Влияние температуры на активность нитрилгидратазы штамма Bacillus cereus В5.

Бактерии Bacillus cereus В5 выращивали в течение 24 ч и подготавливали к трансформации по примеру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, pH 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации для заявляемого штамма представлено в табл. 5.

Таким образом, нитрилгидратаза из заявляемого штамма обладает удовлетворительной термостабильностью.

Заявляемый штамм может применяться для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах.

Список литературы
1. Brennan, B.A., Alms, G., Nelson, M.J., Dumey, L.T. and Scarrow, R.C. (1996b) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 contains a non-corrin cobalt ion with two sulfur ligands. J. Am. Chem. Soc. 118, 9194-9195.

2. Nagamune, Т., Honda, J., Cho, W.D., Kamiya, N., Teratani, Y., Hirata, A., Sasabe, H. and Endo, I. (1991) Cristallization of a photosensitive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771. J. Mol. Biol. 220, 221-222.

3. Korf, M. -A., Honda, J., Teratani, Y., Kobayashi. Y., Nagamune, T., Sasabe, H., Hirata, A., Ambe, F. and Endo, I. (1992) Light- induced oxidation of iron atoms in a photosensitive nitrile hydratase. FEBS Lett. 301, 177- 180.

4. Nagasava, T. , Nanba, H., Ryuno, K. and Yamada, H. (1987) Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororaphis B23. Purification and characterization. Eur. J. Biochem. 162, 691-698
5. Bonnet, D., Artaud, I., Petre, D. and Mansuy, D. (1996) Key role of alkanoic acids on the spectral properties, activity, and active-site stability of iron-containing nitrile hydratase from Brevibacterium R312. Eur. J. Biochem. 240, 239-244.

6. Патент N 1731814 SU.

7. Патент N 05395758 US.

8. Патент N 1811698 SU.

9. Патент N 2112804 RU.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus cereus – продуцент нитрилгидратазы.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.11.2007

Извещение опубликовано: 10.07.2009 БИ: 19/2009