Патент на изобретение №2327142

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ АЭРОЗОЛЬНЫХ ФИЛЬТРОВ В ОТНОШЕНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к способам определения коэффициентов проницаемости микроорганизмов и может быть использовано для контроля эффективности фильтров тонкой очистки воздуха и средств индивидуальной защиты в биотехнологии, санитарной, медицинской и прикладной микробиологии при работе с микроорганизмами и их токсинами. Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов заключается в приготовлении жидкого тест-препарата, диспергировании его в аэрозоль до фильтра, отборе проб аэрозоля до и после фильтра, определении в пробах аэрозоля содержания биологического маркера. В качестве маркера используют тест-препарат белков, инициирующих льдообразование, регистрацию льдообразующей активности которых проводят по наличию в пробе центров нуклеации. Техническим результатом изобретения является обеспечение безопасности условий работы. 4 табл.

Изобретение относится к способам определения коэффициентов проницаемости аэрозольных фильтров в отношении бактериальных токсинов белковой природы и может быть использовано для контроля эффективности фильтров тонкой очистки воздуха и средств индивидуальной защиты в биотехнологии, санитарной, медицинской и прикладной микробиологии при работах с микроорганизмами и их токсинами в целях обеспечения безопасности условий труда.

Основной характеристикой фильтров является коэффициент проскока (или проницаемость), равный процентному отношению концентрации частиц в воздухе после фильтра к концентрации частиц в воздухе до фильтра (ГОСТ Р 51251-99. Фильтры очистки воздуха. Классификация. Маркировка: Государственный стандарт Российской Федерации. – М.: ИПК Издательство стандартов, 1999).

Известен способ оценки задерживающей способности аэрозольных фильтров в отношении аэрозолей турбинного масла или диоктилфталата (ГОСТ 10189-62). В нем турбинное масло или диоктилфталат диспергируются в аэрозоль до фильтра с образованием в воздухе частиц размером от 0,17 до 0,36 мкм. Концентрация частиц до и после фильтра определяется без отбора проб нефелометрически.

Недостатками метода являются:

необходимость создания значительных концентраций турбинного масла или диоктилфталата до фильтра для обеспечения чувствительности метода;

диоктилфталат считается потенциально опасным веществом (Carlon H.R., Guelta M.A., Gerber B.V. Some candidate replacement materials for dioctil phthalate in “hot smoke” aerosol penetrometer machines / Aerso) Sci. and Technol. – 1991. – Vol.14, №2. – P.233-246);

загрязнение фильтра маслом;

несоответствие гигроскопических, поверхностных, электростатических и иных значимых физико-химических свойств частиц флуоресцеина натрия, существенных для процессов их задержки фильтрующими материалами, соответствующими свойствам белковых частиц, формируемых бактериальными токсинами.

В практике проверки фильтрующих систем нашло применение аэрозолей флуоресцеина натрия (уранина) (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт), диспергируемых пневматическими распылителями до частиц размером менее 1 мкм. Количественная регистрация уранина в пробах аэрозоля, отбираемых до и после фильтра, осуществляется флуориметрически.

Недостатком метода является:

несоответствие гигроскопических, поверхностных, электростатических и иных значимых физико-химических свойств частиц турбинного масла или диоктилфталата, существенных для процессов их задержки фильтрующими материалами, соответствующими свойствам белковых частиц, формируемых бактериальными токсинами;

загрязнение фильтра красителем, его накопление в помещениях, что приводит к постепенному нарастанию уровню фона в коммуникациях вентиляционных систем и помещениях и необходимости корректировки результатов по уровню фона.

Наиболее близким является способ определения коэффициента проскока аэрозольных фильтров в отношении тест-аэрозолей микроорганизма Serratia marcescens (Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях / С.Г.Дроздов, Н.С.Гарин, Л.С.Джиндоян, В.М.Тарасенко. – М.: Медицина, 1987, СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности: Санитарные правила. – М.: Информ. – изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999); СП 1.3.1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарные правила. – М.: Информ. – изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 2003).

Сущность метода состоит в отборе пробоотборниками проб аэрозоля до и после фильтра во время диспергирования суспензии Serratia marcescens перед фильтром при заданных условиях испытаний, определении в пробах концентраций аэрозоля Serratia marcescens и расчете по ним коэффициента проницаемости фильтра (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт).

К недостаткам данного метода следует отнести:

невозможность характеристики проникания через фильтрующие материалы белковых веществ, характеризующихся значительно меньшими размерами, чем клетки Serratia marcescens;

длительность определения, связанная с бактериологическим методом определения количества жизнеспособных клеток;

значительная инактивация клеток при прохождении коммуникаций вентиляционных систем и фильтров, влияющая на достоверность определения коэффициента проскока;

необходимость использования дорогостоящих питательных сред;

необходимость осуществления организационных и технических мероприятий по обеспечению биологической безопасности в связи с тем, что микроорганизм Serratia marcescens относится к IV группе патогенности (СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности: Санитарные правила. – М.: Информ. – изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999).

Общими с заявленным способом являются

приготовление жидкого тест-препарата;

диспергирование тест-препарата в аэрозоль до фильтра;

отбор проб аэрозоля до фильтра и после него в процессе диспергирования тест-препарата;

определение в пробах аэрозоля содержания биологического маркера (трассера) – жизнеспособных бактериальных клеток или активных ЦН;

расчет коэффициента проскока фильтра.

Задачей изобретения является разработка способа определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении бактериальных токсинов, представляющих собой глобулярные белковые комплексы, сформированные из нескольких субъединиц и имеющие размеры, существенно меньшие, чем микробные клетки.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе определения проницаемости аэрозольных фильтров предусмотрено использование:

препаратов бактериальных белков, инициирующих льдообразование (БИЛ), в качестве маркера, регистрация льдообразующей активности которых проводится по наличию в пробе центров нуклеации (ЦП) переохлажденной воды, формируемых белками этого типа;

микрокапельной криоскопической методики для количественного обнаружения ЦН в пробах, суть которой заключается в подсчете относительного числа кристаллизующихся микрокапель серийных разведений исследуемых проб при определенной температуре переохлаждения и использовании известной зависимости концентрации ЦН от доли замерзающих микрокапель, подчиняющейся распределению Пуассона;

рациональной температуры анализа, находящейся в интервале от минус 7°С до минус 11°С, т.к. при этой температуре чистая вода и разбавленные растворы солей, не содержащие гетерогенных ядер нуклеации, в микрокаплях сохраняются в переохлажденном состоянии продолжительное время;

мини-криостата с регулируемой температурой, сконструированного на основе элементов Пельтье, обеспечивающего охлаждение и термостабилизацию рабочей поверхности с точностью ±0,1°С в интервале температур от минус 1°С до минус 13°С;

Способ включает следующие этапы:

приготовление белкового тест-препарата;

диспергирование тест-препарата в аэрозоль до фильтра;

отбор проб аэрозоля до фильтра и после него в процессе диспергирования тест-препарата;

определение в пробах аэрозоля содержания активных ЦН;

расчет коэффициента проскока фильтра.

Способ выполняется следующим образом.

Для получения тест-препарата выращивают культуру продуцента, из которой выделяют БИЛ.

Выращивание микробов-продуцентов осуществляют на плотной питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса, содержащей аминный азот в количестве (110±10) мг% и имеющей величину рН (7,2±0,2) ед. рН. Получение микробных культур производят при температуре (24±2)°С в течение 3 суток с последующим смывом колоний физиологическим раствором хлористого натрия с добавлением стеклянных бус.

Выделение белка БИЛ осуществляют путем разрушения клеток суспензии микроорганизмов встряхиванием со стеклянными бусами или ультразвуковой обработкой. БИЛ осаждают из культуральной жидкости солевым методом в присутствии гексаметафосфата натрия или сульфата аммония при рН среды 3,5-5,0 ед. с последующим центрифугированием.

На основе полученной белковой пасты готовят тест-препарат, имеющий удельную активность не менее 5,0·10⁸ ЦН·см^-3 (при диспергировании в течение не менее 10 минут не менее 10 см³ тест-препарата при коэффициенте перевода в аэрозоль 0,3 отн.ед. данная концентрация ЦН обеспечивает получение в аэрозоле до фильтра с минимальной производительностью 750 м³/ч требуемой концентрации трассера около 1·10⁷ у.е.·м^-3 (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт) для расчета коэффициента проскока на уровне 1·10^-4%).

Используемые генераторы аэрозоля должны обеспечивать создание перед фильтром аэрозоля с концентрацией порядка 1·10⁷ ЦН·м^-3, состоящего в основном из частиц размером менее 10 мкм.

Для регистрации ЦН в пробах проводят следующие операции.

По описанию, прилагаемому к криостату, готовят прибор к работе. Устанавливают рабочую температуру минус 7°С или ниже.

Разводящую жидкость – фосфатный буферный раствор – готовят на основе растворов солей однозамещенного и двузамещенного фосфорнокислого калия и дистиллированной воды. Концентрация водородных ионов должна находиться в пределах 7,3-7,6 ед. рН. Приготовленный фосфатный буферный раствор подвергают автоклавированию при 120°С в течение 30 минут. Стерильный фосфатный буферный раствор проверяют на наличие абиогенных центров нуклеации. Для этого его разливают в стерильные пробирки по 4-10 см³ и замораживают в криостате при температуре минус (7-9)°С в течение 5 мин. Замерзшие при этой температуре пробирки выбраковывают.

Стерильные мерные пробирки в количестве, необходимом для выполнения требуемых десятикратных разведений, заполняют 4,5 см³ фосфатным буферным раствором.

Приготовление парафинированных кювет из алюминиевой фольги, необходимых для размещения микрокапель исследуемой жидкости, осуществляют следующим образом. Кюветы готовят в виде круга диаметром 8-10 см с загнутыми краями с высотой бортов 5-10 мм. Из переплавленного парафина готовят 3% раствор в ксилоле или хлороформе. Раствор парафина наносят на рабочую поверхность кюветы с избытком. Излишек раствора сливают. Кюветы подсушивают в течение 2-3 минут над пламенем спиртовки для испарения растворителя.

В качестве сорбирующей жидкости для пробоотборников используют физиологический раствор или фосфатный буферный раствор, приготовленный вышеприведенным способом.

Диспергируют тест-препарат пневматическим распылителем, оснащенным отсекателем грубой фракции частиц генерируемого аэрозоля, в воздуховод до фильтра в течение не менее 10 минут для получения аэрозоля с преимущественным размером частиц менее 1 мкм.

Отбирают пробы аэрозоля до и после фильтра в соответствии с требованиями ОСТ Д-504-91ССБТ.

Исследуемую пробу сорбирующей жидкости из пробоотборников тщательно перемешивают и 0,5 см³ вносят в первую пробирку с фосфатным буфером. Дальнейшие разведения осуществляют десятикратным шагом. Анализу подвергают исходную пробу и все 5-8 десятикратных разведений.

Микропипеткой наносят на поверхность алюминиевой парафинированной кюветы по 20-40 капель (объемом 0,01 см³) контролей (фосфатный буферный раствор и сорбирующая жидкость) и каждого анализируемого разведения отобранной из аэрозоля пробы. Кюветы устанавливают в камеру криостата и визуально определяют количество замерзших капель на каждой кювете через три минуты с момента начала кристаллизации. Замерзание капель регистрируют по их помутнению. Изменяют температуру охлаждающей поверхности криостата и через 3 мин повторяют подсчет числа замерзших микрокапель при новой температуре.

При расчете концентрации ЦН используют кюветы, в которых отмечено замерзание части нанесенных капель. Анализ считается зачетным, если в контролях (фосфатном буферном растворе и сорбирующей жидкости) ЦН при выбранной температуре не регистрируются.

Расчет концентрации ЦН в пробе ведут следующим порядком.

Для каждого разведения пробы (i) по формулам (1) и (2) рассчитывают долю замерзших капель – эффект кристаллизации (f_i) и соответствующую этому эффекту концентрацию центров нуклеации (C_fi):

где f_i – эффект кристаллизации, доля;

С_fi – концентрация БИЛ в исследуемой жидкости, ЦН см^-3;

N_oi – общее количество зачетных капель исследуемого разведения на данной кювете;

N_3i – число замерзших капель исследуемого разведения на данной кювете;

d – степень разведения;

V – объем капли на кювете (например 0,01 см³).

На основе полученных значений методом наименьших квадратов рассчитывают концентрацию ЦН, соответствующую 50% эффекту кристаллизации.

Статистическую обработку результатов параллельных определений выполняют в соответствии с общепринятыми методами.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в табл. 1.

Возможность осуществления предлагаемого способа показана на следующих примерах.

Пример 1. Генерирование аэрозоля тест-препарата БИЛ с преимущественным размером частиц менее 1 мкм.

Жидкие тест-препараты диспергированы в аэрозольную камеру объемом 1 м³ при помощи прямоструйного пневматического распылителя, оснащенного отсекателем частиц грубой фракции. Анализ дисперсного состава полученных аэрозолей проведен с использованием оптического аэрозольного счетчика ОАС-0,3. Результаты анализа дисперсного состава аэрозолей БИЛ представлены в табл. 2.

Полученные данные свидетельствуют о возможности получения из жидких препаратов БИЛ тест-аэрозолей, содержащих преимущественно частицы размером менее 1 мкм, необходимые для оценки проницаемости аэрозолей белковых комплексов.

Пример 2. Оценка проникающей способности аэрозолей, генерированных из жидких препаратов БИЛ при помощи прямоструйных распылителей с отсекателями грубодисперсной фракции. Проверено проникание аэрозолей через фильтры (см. табл. 3). Анализ проскока БИЛ через фильтры выполнен на фильтровентиляционной системе с производительностью 1500 м³·ч^-1 в соответствии с требованиями (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт) с использованием жидкого тест-препарата БИЛ вместо тест-препарата S. marcescens. Пробы аэрозоля отбирали с использованием микроциклонов, содержавших 10 см³ сорбирующей жидкости (физиологического раствора), с производительностью 10 дм³·мин^-1.

Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что коэффициент проскока БИЛ через фильтры составил (1,1±0,2)·10^-2% и оказался в среднем на три порядка выше, чем коэффициент проскока тест-аэрозоля S. marcescens, составивший в контрольных опытах на данной ФВС (1,6-25,0)·10^-6%.

Пример 3. Оценка проникающей способности аэрозолей, генерированных из жидких препаратов БИЛ при помощи прямоструйных распылителей с отсекателями грубодисперсной фракции. Проверено проникание аэрозолей через фильтр противогазовых коробок (см. табл. 4). При проверке противогазовых коробок аэрозоль БИЛ создавали в статической аэрозольной камере. Аэрозоль отбирали через коробки в течение 10 мин с производительностью 10 дм³·мин^-1. Пробы аэрозоля отбирали микроциклонами с сорбирующей жидкостью (см. пример 2).

Формула изобретения

Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов, включающий приготовление жидкого тест-препарата, диспергирование его в аэрозоль до фильтра, отбор проб аэрозоля до и после фильтра, определение в пробах аэрозоля содержания биологического маркера, отличающийся тем, что в качестве маркера используют тест-препарат белков, инициирующих льдообразование, регистрацию льдообразующей активности которых проводят по наличию в пробе центров нуклеации; белки, инициирующие льдообразование, выделяют путем разрушения клеток штамма-продуцента механической или ультразвуковой обработкой с последующим солевым осаждением и центрифугированием; из полученной белковой пасты готовят тест-препарат, имеющий удельную активность не менее 5,0·10⁸ центров нуклеации в см³; полученный тест-препарат диспергируют в аэрозоль с концентрацией 1·10⁷ центров нуклеации в см³; концентрацию центров нуклеации рассчитывают согласно микрокапельной криоскопической методике, основанной на использовании закона Пуассона для описания вероятности обнаружения центров нуклеации в микрокаплях и расчета концентрации, соответствующей 50% эффекту кристаллизации в группах микрокапель при температуре от минус 7 до минус 11°С, с использованием метода наименьших квадратов; коэффициент проницаемости рассчитывают путем деления концентрации центров нуклеации в пробах после фильтра на концентрацию центров нуклеации в пробах перед фильтром.