Патент на изобретение №2326689

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА VIII ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ПРОДУКТ ЕГО СОДЕРЖАЩИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области препаративной биохимии, фармации и медицины и касается способа получения концентрата VIII фактора свертывания крови и продукта его содержащего. Способ включает использование в качестве источника криопреципитата плазмы крови, добавление гепарина, ПЭГ-4000, центрифугирование, к супернатанту добавляют трибутилфосфат и твин 80, повторное центрифугирование, осадок, отмытый хлористым натрием, растворяют в трис-HCl буфере с добавками, пропускают через колонку, заполненную гелем с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда, элюцию фактора VIII, диализ. Полученный концентрат не содержит фактора Виллебранда и имеет активность не менее 300 МЕ/мг белка с чистотой не менее 98%, и содержит альбумин до концентрации 0,1%. Продукт лиофилизован с последующей термообработкой. Изобретение позволяет получить продукт, который является апирогенным, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывает аллергических реакций и может быть использован в медицине, в ветеренарии, в научно-исследовательских целях. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области препаративной биохимии, фармации и медицины и касается способа получения концентрата VIII фактора свертывания крови и продукта его содержащего.

Фактор VIII играет важную роль в системе свертывания крови и является основным компонентом лекарственных средств, предназначенных для лечения гемофилии. В плазме крови его содержание невелико и составляет десятитысячные доли процента по отношению к общему белку. Это и определяет главную проблему в создании препаратов, содержащих данный фактор – необходимость в высокой эффективности технологических процессов их получения, учитывая главную составляющую себестоимости – стоимость плазмы крови человека. Все препараты, содержащие данный фактор, делятся по способу их получения на генно-инженерные и препараты, полученные из плазмы крови человека. Последняя группа представляет собой концентраты разной степени очистки. Максимальная очистка достигается с использованием моноклональных антител, пришитых к тому или иному носителю, минимальная – заключается в двух-трех нехроматографических стадиях очистки криопреципитата. Препараты промежуточной степени очистки получают с использованием комбинации тех или иных хроматографических методов. Такое разнообразие препаратов, содержащих фактор VIII, объясняется отсутствием единого мнения о необходимой и достаточной степени очистки от других компонентов плазмы крови.

Принципиальное различие технологий базируется на разном подходе к спектру белков, находящихся в конечной готовой лекарственной форме фактора VIII. Прежде всего это касается вопроса о необходимости очистки от фактора Виллебранда. Дело в том, что с одной стороны, фактор Виллебранда, находясь в комплексе с фактором VIII, стабилизирует последний, с другой, субъединицы фактора Виллебранда образуют огромные комплексы между собой. Поэтому, даже если очиститься от всех остальных белков плазмы крови, удельная активность фактора VIII в таком препарате будет далека от оптимальной (когда фактора Виллебранда в препарате нет вообще или молярное отношение фактор VIII: фактор Виллебранда 1:1) и будет определяться соотношением факторов. Известно, что такое отношение in vitro может достигать 1:100. А, учитывая еще и большую молекулярную массу фактора Виллебранда по отношению к фактору VIII, становится очевидной необходимость разрушения такого надмолекулярного комплекса фактора Виллебранда. В этом случае независимо от использования других технологических приемов можно ожидать больший выход и большую удельную активность фактора VIII в конечном препарате как высокой, так и низкой степени очистки.

Вопрос о том, как и на каком этапе выделения фактора VIII необходимо разрушить агрегат фактора Виллебранда, тесно связан с проблемой поддержания стабильности фактора VIII в процессе его выделения и очистки. После удаления факторов, понижающих стабильность фактора VIII, таких как протромбин и тромбин, наибольшее инактивирующее воздействие на него могут оказать процедуры вирусной инактивации. Дело в том, что это довольно жесткие процедуры и их проведение тем или иным способом требует наличия стабилизирующих факторов. Отчасти сам комплекс фактора VIII и фактора Виллебранда выполняет такую функцию. Поэтому разрушение надмолекулярных агрегатов фактора Виллебранда надо проводить либо после процедуры вирусной инактивации, либо искусственно вводить дополнительные стабилизаторы.

Известны способы получения концентрата фактора VIII, в частности, описанные в патентах RU 2025129, RU 2148411, RU 2055593.

Наиболее близким является способ, описанный в патенте RU 2253475.

Суть настоящего изобретения заключается в том, что разработан способ получения препаратов, содержащих фактор VIII, отличающийся тем, что с помощью тиол-дисульфидного обмена разрушались надмолекулярные комплексы фактора Виллебранда, активность фактора VIII при этом не затрагивалась. Предлагаемый способ позволил разработать метод получения препаратов, содержащих фактор VIII, отличающийся большей эффективностью и удельным содержанием по сравнению с аналогичными методами, но не включающими эту стадию.

Другим аспектом заявленного изобретения является продукт для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях, содержащий концентрат активного VIII фактора свертывания крови человека с удельной активностью не менее 300 МЕ/мг и 0,1% альбумина, и чистотой более 98%, полученный способом, приведенным в описании и в формуле.

Продукт может быть представлять собой раствор или лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом). В случае необходимости он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного – струйно или инфузией, внутримышечного, интраназального) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам. Наполнителями являются, например, сахара (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза или их смеси), восстановительные сахара (эритрол, маннитол и др.) в физиологически приемлемых концентрациях, в случае необходимости – антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. Дополнительно продукт может содержать неорганические и/или органические соли и их сочетания для поддержания приемлемых значений рН.

Растворителями для лиофилизированного продукта могут служить дистиллированная апирогенная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор.

Также можно лиофилизировать готовый продукт, содержащий концентрат VIII фактора и любой из перечисленных, вспомогательных веществ, в частности альбумин или их сочетание.

Продукт может иметь соответствующую упаковку и, необязательно, инструкцию по применению.

Осуществление способа поясняется следующими примерами.

Пример 1.

1 кг криопреципитата плазмы крови растворяли в течение 1 часа в воде, содержащей гепарин (3 ед./мл) при температуре 25°С. Добавляли гидроокись алюминия, доводили рН до 7,0 и после 15 минутной инкубации центрифугировали. К полученному супернатанту добавляли гепарин до конечной концентрации 3 ед./мл, после этого добавляли 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 2 мМ и инкубировали в течение часа, затем добавляли полиэтиленгликоль – 4000 до конечной концентрации 2%. После доведения рН до 6,6 инкубировали в течение 15 минут и центрифугировали. Осадок отбрасывали, а супернатант диализовали против воды, содержащей гепарин (3 ед./мл), добавляли глицин до конечной концентрации 13% и инкубировали в течение часа. Затем центрифугировали, осадок отбрасывали. К супернатанту добавляли трибутилфосфат до конечной концентрации 0,3% и твин 80 до конечной концентрации 1%, подводили рН до 7,2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 6 часов. После этого добавляли хлорид натрия до конечной концентрации 14%, инкубировали в течение часа и центрифугировали. Осадок отмывали раствором хлорида натрия и диализовали против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина. Удельная активность составляла около 60 МЕ/мг общего белка. Добавляли альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтровали и подвергали лиофилизации в сочетании с последующей термообработкой. Выход процесса по активности фактора VIII составлял около 60%.

Пример 2. Предпочтительный вариант осуществления способа.

Осадок концентрата фактора VIII получали, как в примере 1. После отмывания осадка раствором хлорида натрия его растворяли в 10 мМ трис HCl буфере, содержащем 100 мМ хлорид натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 10 мМ лизин и 5 ед./мл гепарина. Раствор пропускали через аффинную колонку, содержащую 1 л геля с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда (anti-vWF gel, Immunotech, France). Элюцию фактора VIII проводили после промывки 8 колоночными объемами уравновешивающего буфера. В состав элюирующего буфера входили 10 мМ трис HCl, 250 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, 2,5 мМ хлорида кальция, 250 мМ сульфата аммония, 2,55% глицерина. Полученный раствор диализовали против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина. Удельная активность составляла около 300 МЕ/мг. Добавляли альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтровали и подвергали лиофилизации в сочетании с последующей термообработкой. Выход процесса по активности фактора VIII составлял около 70%.

Чистота продукта не менее 98%.

Полученный продукт является апирогенным, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывает аллергических реакций и может быть использован в медицине, в ветеренарии, в научно-исследовательских целях.

Формула изобретения

1. Способ получения концентрата VIII фактора свертывания крови человека, характеризующийся тем, что криопреципитат плазмы крови растворяют в воде, содержащей 3 ед./мл гепарина при температуре 25°С, добавляют гидроокись алюминия, доводят рН до 7,0, инкубируют, центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют гепарин, затем 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 3 ед./мл и 2 мМ соответственно, инкубируют в течение часа, добавляют полиэтиленгликоль – 4000 до конечной концентрации 2%, доводят рН до 6,6, инкубируют 15 мин, центрифугируют, супернатант диализуют против воды, содержащей гепарин 3 ед./мл, далее добавляют глицин до конечной концентрации 13%, инкубируют в течение часа, центрифугируют, к супернатанту добавляют трибутилфосфат до конечной концентрации 0,3% и твин 80 до конечной концентрации 1%, доводят рН до 7,2, инкубируют при комнатной температуре в течение 6 ч, после этого добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 14%, инкубируют в течение часа, центрифугируют, осадок отмывают раствором хлорида натрия, растворяют в 10 мМ трис HCl буфере, содержащем 100 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 10 мМ лизина и 5 ед./мл гепарина, раствор пропускают через колонку, заполненную гелем с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда, элюируют буфером, состоящим из 10 мМ трис HCl, 250 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, 2,5 мМ хлорида кальция, 250 мМ сульфата аммония, 2,55% глицерина, полученный раствор диализируют против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина, к полученному концентрату, имеющему удельную активность не менее 300 МЕ/мг белка, добавляют альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтруют, лиофилизируют и подвергают термообработке.

2. Продукт, представляющий собой концентрат VIII фактора свертывания крови, характеризующийся тем, что получен способом по п.1, имеет удельную активность не менее 300 МЕ/мг белка с чистотой не менее 98% и содержит альбумин до концентрации 0,1%.

3. Продукт по п.2, характеризующийся тем, что представляет собой раствор или лиофилизированный порошок.

4. Продукт по п.2, характеризующийся тем, что дополнительно содержит фармацевтические наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального введения.

5. Продукт по любому из пп.2-4 для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях.

6. Продукт по п.5 для лечения или предупреждения состояний, связанных с недостатком VIII фактора.