Патент на изобретение №2326384

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАЦЕТАНИЛИДНЫХ ГЕРБИЦИДОВ (АЦЕТОХЛОР, БУТАХЛОР, АЛАХЛОР) С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА

(57) Реферат:

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения хлорацетанилидных гербицидов в объектах окружающей среды – почве, продуктах питания, промышленных сточных и природных водах. Способ осуществляют с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, причем пробу, содержащую хлорацетанилидный гербицид, обрабатывают ацетонитрилом в присутствии сульфата аммония и к экстракту добавляют фиксированное количество антител в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5), затем наносят на поверхность сенсора с покрытием на основе хлорацетанилид-белкового конъюгата и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии хлорацетанилид-белкового конъюгата с антителами к хлорацетанилидному гербициду относительно сенсора сравнения с рецепторным слоем на основе белка, аналитический сигнал обратно пропорционален концентрации хлорацетанилидного гербицида в пробе, для проведения последующих определений осуществляют регенерацию рецепторного слоя нанесением на его поверхность раствора тиоцианата калия, обеспечивая многократное использование сенсора. Достигается повышение чувствительности и селективности, а также – ускорение анализа. 1 табл.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного определения хлорацетанилидных гербицидов (ацетохлора, бутахлора, алахлора) в объектах окружающей среды – почве, продуктах питания, промышленных сточных и природных водах.

Известен способ определения хлорацетанилидных гербицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор) с применением иммуноферментного анализа (WEB: www.abraxiskits.com). Недостатками данного способа являются относительно низкая чувствительность (например, предел обнаружения ацетохлора 0,19 нг/мл, что превышает ПДК), продолжительность (включает несколько стадий), одноразовое использование дорогостоящих биореагентов, косвенное определение аналитов после введения в пробу дополнительных ферментных меток.

Задачей настоящего изобретения является снижение предела обнаружения хлорацетанилидных гербицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор), увеличение чувствительности определения и уменьшение его продолжительности в сложных по составу пробах с последующей регенерацией иммунореагентов.

Поставленная задача решается тем, что пробу, содержащую хлорацетанилидный гербицид, обрабатывают ацетонитрилом в присутствии сульфата аммония и к экстракту добавляют фиксированное количество антител в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5). Полученный раствор экстракта в фосфатном буфере наносят на поверхность сенсора с покрытием на основе хлорацетанилид-белкового конъюгата и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии хлорацетанилид-белкового конъюгата с антителами к хлорацетанилидному гербициду относительно сенсора сравнения с рецепторным слоем на основе белка. Аналитический сигнал обратно пропорционален концентрации хлорацетанилидного гербицида в анализируемой пробе. Регенерацию рецепторного покрытия для проведения последующих определений осуществляют нанесением на поверхность раствора тиоционата калия, обеспечивая многократное использование сенсора.

При осуществлении пробоподготовки микроэкстракцией к 1 мл анализируемой пробы, содержащей хлорацетанилидный гербицид (ацетохлор, бутахлор, алахлор), добавляют 217 мкл ацетонитрила и 0,5370 г высаливателя – (NH₄)₂SO₄ и перемешивают в течение 2 мин до выделения органического растворителя в самостоятельную фазу. Органическую фазу отбирают микрошприцем и используют для анализа. Для этого к 1 мкл экстракта на основе ацетонитрила, содержащего хлорацетанилидный гербицид, добавляют раствор сыворотки, содержащий соответствующие антитела, отвечающий 50%-ному связыванию в гетерогенный иммунокомплекс. Смесь доводят фосфатным буферным раствором до 1 мл (рН=7,1-7,5) и выдерживают до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С.

Далее на поверхность массочувствительного пьезокварцевого иммуносенсора с рецепторным покрытием на основе хлорацетанилид-белкового конъюгата (ацетохлор-, бутахлор-, алахлор-), наносят предварительно подготовленную пробу в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5), содержащую хлорацетанилидный гербицид и фиксированное количество антител к нему, и регистрируют изменение частоты колебаний сенсора при взаимодействии хлорацетанилид-белкового конъюгата с антителами к хлорацетанилидному гербициду относительно сенсора сравнения, содержащего белковую молекулу. В качестве аналитического сигнала сенсора используют разность изменения частоты колебания индикаторного и сенсора сравнения при взаимодействии хлорацетанилид-белкового конъюгата с поликлональными антителами к соответствующему гербициду, присутствующими в пробе. Аналитический сигнал сенсора обратно пропорционален содержанию хлорацетанилида в анализируемой пробе. После каждого цикла измерения осуществляют регенерацию рецепторного покрытия, нанося на поверхность раствор тиоционата калия.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

– высокая чувствительность способа, позволяющая осуществлять определение хлорацетанилидных гербицидов в жидких средах в интервале концентраций 0,005-0,2 нг/мл, при этом предел обнаружения равен 0,002 нг/мл;

– высокая селективность определения хлорацетанилидного гербицида в сложных по составу смесях, в том числе в присутствии родственных соединений;

– многократное (более 30 раз) использование иммуносенсора вследствие регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения;

– относительно невысокая продолжительность анализа.

Это позволяет проводить определение ацетохлора и алахлора в жидких средах в диапазоне концентраций 0,005-0,2 нг/мл и бутахлора – 0,01-0,4 нг/мл в сложных по составу смесях. Высокая селективность обеспечивается использованием специфичных иммунореагентов – поликлональных антител к хлорацетанилидному гербициду и хлорацетанилид-белковых конъюгатов (белок: БСА – бычий сывороточный альбумин, СТИ – соевый трипсиновый ингибитор, ОВА – овальбумин и др.). Многократное (более 30 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для создания иммуносенсора используется пьезокварцевый массочувствительный резонатор АТ-среза с серебряными электродами диаметром 5-8 мм и собственной частотой колебаний (5-10 МГц)±1 Гц. После тщательной очистки и обезжиривания поверхность серебряного электрода пьезокварцевого резонатора обрабатывают 0,6 мкл 2,5%-го раствора -аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне, высушивают на воздухе и выдерживают 30-40 минут при 70°С. После нанесения 15 мкл 2,5% свежеприготовленного раствора глутарового альдегида и 10 мкл 0,05% раствора хлорацетанилид-белкового конъюгата происходит прочное закрепление биослоя. Сенсор выдерживают 10-12 часов при 4°С во влажной камере

Создание сенсора сравнения проводят аналогично, только на поверхности электродов кварцевого кристалла закрепляют белок, который использовался при создании гаптен-белкового конъюгата.

При проведении измерений пьезокварцевый иммуносенсор закрепляют в ячейке, содержащей силикагель.

При осуществлении пробоподготовки микроэкстракцией к 1 мл анализируемой пробы, содержащей хлорацетанилидный гербицид, добавляют 217 мкл ацетонитрила и 0,5370 г высаливателя – (NH₄)₂SO₄ и перемешивают в течение 2 мин до выделения органического растворителя в самостоятельную фазу. Органическую фазу отбирают микрошприцем и используют для анализа. Для этого к 1 мкл экстракта на основе ацетонитрила, содержащего хлорацетанилидный гербицид, добавляют раствор сыворотки, содержащий соответствующие антитела, отвечающий 50%-ному связыванию в гетерогенный иммунокомплекс, смесь доводят фосфатным буферным раствором (рН=7,1-7,5) до 1 мл и выдерживают до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С.

Перед началом первого измерения пьезокварцевый иммуносенсор выдерживают в фосфатным буферным растворе (рН=7,1-7,5) в течение 30 мин до стабилизации сигнала сенсора. Затем на поверхность обоих сенсоров (индикаторного и сенсора сравнения) наносят предварительно подготовленную пробу (5 мкл), что вызывает снижение частоты колебания сенсора вследствие образования на поверхности электрода иммунокомплекса хлорацетанилид-белкового конъюгата с поликлональными антителами к соответствующему хлорацетанилидному гербициду и неспецифических взаимодействий матричных компонентов пробы (индикаторный сенсор) или только неспецифических взаимодействий матричных компонентов пробы (сенсор сравнения).

В качестве аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора используют изменение частоты колебания сенсора (f) вследствие увеличения массы рецепторного покрытия в результате взаимодействия антител с хлорацетанилид-белковым конъюгатом относительно сенсора сравнения.

Сигнал рассчитывается по следующему уравнению:

f=f_инд–f_сравн,

f=f_m–f,

где f_m – частота колебаний иммуносенсора до начала измерения с предварительно нанесенным биорецепторным слоем; f – минимальная частота колебаний сенсора, соответствующая образованию гетерогенного иммунокомплекса; f_инд – изменение частоты колебаний индикаторного сенсора после нанесения пробы, f_сравн – изменение частоты колебаний сенсора сравнения после нанесения пробы.

После этого оба сенсора промывают буферным раствором до стабилизации сигнала сенсора и наносят регенерирующий раствор, разрушающий образовавшийся иммунный комплекс (индикаторный сенсор). Частота колебаний сенсора при этом возвращается к исходному значению.

Концентрацию хлорацетанилидного гербицида в пробе определяют по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочного графика проводят предварительное концентрирование хлорацетанилидного гербицида методом микроэкстракции. При осуществлении пробоподготовки микроэкстракцией к 1 мл анализируемой пробы, содержащей хлорацетанилидный гербицид с концентрациями 0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 нг/мл, добавляют 217 мкл ацетонитрила и 0,5370 г высаливателя – (NH₄)₂SO₄ и перемешивают в течение 2 мин до выделения органического растворителя в самостоятельную фазу. Коэффициент концентрирования в этом случае составляет 10, т.е. концентрация гербицида в экстракте по сравнению с исходной увеличивается в 10 раз. Органическую фазу отбирают микрошприцем и используют для анализа. Для этого к 1 мкл экстракта на основе ацетонитрила, содержащего хлорацетанилидный гербицид, добавляют раствор сыворотки, содержащий соответствующие антитела, отвечающий 50%-ному связыванию в гетерогенный иммунокомплекс, смесь доводят фосфатным буферным раствором (рН=7,1-7,5) до 1 мл и выдерживают до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С.

Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию аналита в пробе.

Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций в жидких средах для определения

ацетохлора 0,005-0,2 нг/мл: f=-72·с+165;

бутахлора 0,01-0,4 нг/мл: f=-2,2·с+45,6;

алахлора 0,005-0,2 нг/мл: f=-50·с+123,

где f – аналитический сигнал; с – концентрация ацетохлора, бутахлора, алахлора.

Процедура проведения измерений с использованием пьезокварцевого иммуносенсора. К 1 мл исследуемого образца добавляют 217 мкл ацетонитрила и 0,5370 г (NH₄)₂SO₄ и перемешивают в течение 2 мин до выделения органического растворителя в самостоятельную фазу. Затем к 1 мкл экстракта добавляют раствор сыворотки, содержащий соответствующие антитела, отвечающий 50%-му связыванию в гетерогенный иммунокомплекс и доводят до 1 мл фосфатным буферным раствором (рН=7,1-7,5). Подготовленную таким образом пробу наносят на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора и выдерживают в течение 2 мин до образования гетерогенного иммунокомплекса на поверхности серийно выпускаемого отечественного пьезокварцевого сенсора АТ-среза с серебряными электродами (диаметром 5-8 мм) и собственной частотой колебаний (5-10 МГц)±1 Гц. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию хлорацетанилидного гербицида в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляют нанесением на поверхность раствора KCNS 0,02-0,10 мМ. Определение концентрации хлорацетанилидного гербицида осуществляют по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Пример 1. К 1 мл исследуемого образца с концентрацией хлорацетанилидного гербицида (ацетохлор, алахлор) 0,002 нг/мл добавляют 217 мкл ацетонитрила и 0,5370 г (NH₄)₂SO₄ и перемешивают в течение 2 мин до выделения органического растворителя в самостоятельную фазу. Затем к 1 мкл экстракта добавляют раствор сыворотки, содержащий соответствующие антитела, отвечающий 50%-му связыванию в гетерогенный иммунокомплекс и доводят до 1 мл фосфатным буферным раствором (рН=7,1-7,5). Подготовленную таким образом пробу наносят на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора и выдерживают в течение 2 мин до образования гетерогенного иммунокомплекса на поверхности серийно выпускаемого отечественного пьезокварцевого резонатора АТ-среза с серебряными электродами (диаметром 5-8 мм) и собственной частотой колебаний (5-10 МГц)±1 Гц. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию хлорацетанилидного гербицида в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляют нанесением на поверхность раствора KCNS 0,02-0,10 мМ. Определение концентрации хлорацетанилидного гербицида осуществляют по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

ацетохлор: f=164; найдено 0,001 нг/мл;

алахлор: f=121; найдено 0,001 нг/мл.

Предел обнаружения ацетохлора (алахлора) – 0,002 нг/мл. Разработанный метод не позволяет проводить количественное определение концентраций гербицидов на уровне 0,002 нг/мл.

Пример 2. Исследуемый образец хлорацетанилидного гербицида (бутахлор) с исходной концентрацией 0,005 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=45 Гц; найдено 0,002 нг/мл. Предел обнаружения бутахлора – 0,005 нг/мл. Разработанный метод не позволяет проводить количественное определение концентраций бутахлора на уровне 0,005 нг/мл.

Пример 3. Исследуемый образец хлорацетанилидного гербицида (ацетохлор, бутахлор, алахлор) с исходной концентрацией 0,02 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

ацетохлор: f=151 Гц; найдено 0,02 нг/мл;

бутахлор f=45 Гц; найдено 0,02 нг/мл;

алахлор f=113 Гц; найдено 0,02 нг/мл.

Предел обнаружения ацетохлора (алахлора) – 0,002 нг/мл, бутахлора – 0,005 нг/мл.

Пример 4. Исследуемый образец хлорацетанилидного гербицида (ацетохлор, бутахлор, алахлор) с исходной концентрацией 0,05 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

ацетохлор: f=129 Гц; найдено 0,05 нг/мл;

бутахлор f=44 Гц; найдено 0,05 нг/мл;

алахлор f=98 Гц; найдено 0,05 нг/мл.

Предел обнаружения ацетохлора (алахлора) – 0,002 нг/мл, бутахлора – 0,005 нг/мл.

Пример 5. Исследуемый образец хлорацетанилидного гербицида (ацетохлор, бутахлор, алахлор) с исходной концентрацией 0,1 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

ацетохлор: f=93 Гц; найдено 0,1 нг/мл;

бутахлор f=43 Гц; найдено 0,1 нг/мл;

алахлор f=73 Гц; найдено 0,1 нг/мл.

Предел обнаружения ацетохлора (алахлора)- 0,002 нг/мл, бутахлора – 0,005 нг/мл.

Пример 6. Исследуемый образец хлорацетанилидного гербицида (ацетохлор, бутахлор, алахлор) с исходной концентрацией 0,2 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

ацетохлор: f=21 Гц; найдено 0,2 нг/мл;

бутахлор f=41 Гц; найдено 0,2 нг/мл;

алахлор f=23 Гц; найдено 0,2 нг/мл.

Предел обнаружения ацетохлора (алахлора) – 0,002 нг/мл, бутахлора – 0,005 нг/мл.

Пример 7. Исследуемый образец бутахлора с исходной концентрацией 0,3 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=39 Гц; найдено 0,3 нг/мл. Предел обнаружения бутахлора – 0,005 нг/мл.

Пример 8. Исследуемый образец бутахлора с концентрацией 0,4 нг/мл после предварительной пробоподготовки (пример 1) наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=37 Гц; найдено 0,3 нг/мл.

Предел обнаружения бутахлора – 0,005 нг/мл.

Пример 9. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий ацетохлор и структурный аналог (бутахлор, алахлор) в соотношении концентраций 1:1, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=129 Гц. Присутствие структурных аналогов (бутахлора, алахлора) не оказывает влияние на определение ацетохлора.

Пример 10. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий ацетохлор и структурный аналог (бутахлор, алахлор) в соотношении концентраций 1:2, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=129 Гц. Присутствие структурных аналогов (бутахлора, алахлора) не оказывает влияние на определение ацетохлора.

Пример 11. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий ацетохлор и структурный аналог (бутахлор, алахлор) в соотношении концентраций 1:10, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=129 Гц. Присутствие структурных аналогов (бутахлора, алахлора) не оказывает влияние на определение ацетохлора.

Пример 12. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий бутахлор и структурный аналог (ацетохлор, алахлор) в соотношении концентраций 1:1, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=43 Гц. Присутствие структурных аналогов (ацетохлора, алахлора) не оказывает влияние на определение бутахлора.

Пример 13. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий бутахлор и структурный аналог (ацетохлор, алахлор) в соотношении концентраций 1:2, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=43 Гц. Присутствие структурных аналогов (ацетохлора, алахлора) не оказывает влияние на определение бутахлора.

Пример 14. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий бутахлор и структурный аналог (ацетохлор, алахлор) в соотношении концентраций 1:10, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=43 Гц. Присутствие структурных аналогов (ацетохлора, алахлора) не оказывает влияние на определение бутахлора.

Пример 15. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий алахлор и структурный аналог (ацетохлор, бутахлор) в соотношении концентраций 1:1, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=98 Гц. Присутствие структурных аналогов (ацетохлора, бутахлора) не оказывает влияние на определение алахлора.

Пример 16. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий алахлор и структурный аналог (ацетохлор, бутахлор) в соотношении концентраций 1:2, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=98 Гц. Присутствие структурных аналогов (ацетохлора, бутахлора) не оказывает влияние на определение алахлора.

Пример 17. Исследуемый образец 5 мкл, содержащий алахлор и структурный аналог (ацетохлор, бутахлор) в соотношении концентраций 1:10, наносили на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора в фосфатном буферном растворе (рН=7,1-7,5) и выдерживали в течение 2 мин. Далее аналогично примеру 1.

f=98 Гц. Присутствие структурных аналогов (ацетохлора, бутахлора) не оказывает влияние на определение алахлора.

Данный способ позволяет существенно увеличить чувствительность определения ацетохлора (бутахлора, алахлора) в сложных по составу смесях, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Предел обнаружения ацетохлора (алахлора) равен 0,002 нг/мл, бутахлора – 0,005.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения ацетохлора (бутахлора, алахлора) в жидких средах приведена в таблице.

Формула изобретения

Способ высокочувствительного и селективного определения хлорацетанилидных гербицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор) с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, отличающийся тем, что пробу, содержащую хлорацетанилидный гербицид, обрабатывают ацетонитрилом в присутствии сульфата аммония и к экстракту добавляют фиксированное количество антител в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5), затем наносят на поверхность сенсора с покрытием на основе хлорацетанилид-белкового конъюгата и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии хлорацетанилид-белкового конъюгата с антителами к хлорацетанилидному гербициду относительно сенсора сравнения с рецепторным слоем на основе белка, аналитический сигнал обратно пропорционален концентрации хлорацетанилидного гербицида в пробе, для проведения последующих определений осуществляют регенерацию рецепторного слоя нанесением на его поверхность раствора тиоцианата калия, обеспечивая многократное использование сенсора.