Патент на изобретение №2160599

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью. Надземную часть панцерии шерстистой экстрагируют 50 – 55% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 14 – 16 с учетом коэффициента водопоглощения при 55 – 65^oC. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом, 2-ом и 3-ем контактах фаз 60 мин. Извлечения фильтруют, объединяют, упаривают и очищают сепарированием. Очищенный экстракт высушивают в вакуумной сушилке и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 28,9 0,5% от исходной массы растительного сырья. Изобретение позволяет повысить содержание активных веществ в продукте. 10 табл.

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.

В настоящее время уделяется большое внимание изучению, разработке и внедрению в практику лекарственных препаратов для лечения и профилактики воспалительных заболеваний, поскольку воспалительные заболевания широко распространены, страдают ими лица различного возраста, нередко они сопровождаются тяжелыми клиническими проявлениями и являются причиной частичной или полной утраты трудоспособности больших контингентов населения.

Задачей настоящего изобретения является повышение противовоспалительной активности средства за счет увеличения в нем содержания действующих веществ.

Для достижения указанной задачи растительной материал измельчают до размера частиц не более 5 мм, экстрагируют 50 – 55% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 14 – 16 в течение 60 мин при температуре 60 2,5^oC и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом, 2-ом и 3-ем контактах фаз – 60 минут. Объединенные извлечения фильтруют через серошинельное сукно, упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенное извлечение концентрируют доупаркой до 1/5 первоначального объема, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход сухого продукта составляет 28,90,5%.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом с содержанием влаги не более 5%.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

1 кг травы панцерии шерстистой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 0,5 мм (сито N 50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстрационный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 13 л 50% этилового спирта в соотношении сырье : экстрагент 1 : 14 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 50% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Аналогично проводят и третью экстракцию в течение 60 минут. Первый слив – 10,5 л, второй слив – 9 л, третий – 9 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0,287 кг готового продукта, что составляет 28,7% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги – 5%.

Острая токсичность сухого экстракта определялась на белых беспородных мышах-самцах с исходной массой 20,01,0 г при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введениях растворенного в воде экстракта. Каждую дозу экстракта испытывали на 10 животных. Наблюдение за животными вели в течении 14 дней. Регистрировали наблюдаемые признаки интоксикации, проводили вскрытие и осмотр погибших животных. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении больших доз сухого экстракта панцерии шерстистой белым мышам наблюдаются признаки интоксикации, выражающиеся в замедлении ориентировочной реакции, резких движениях, появлением тонических, а затем тоникоклонических судорог. Животные погибали при явлениях остановки дыхания преимущественно в течении первых суток с начала введения экстракта. LD50 по Керберу при внутрибрюшинном введении сухого экстракта панцерии шерстистой соответствовала 4625,0

В дальнейшем было исследовано влияние экстракта панцерии шерстистой на основные фазы воспалительного процесса. Опыты по влиянию полученного экстракта на процессы альтерации были проведены на 30 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 160.010.0 г. Повреждение ткани в области спинки крыс вызывалось подкожным введением 0,5 мл 9% уксусной кислоты с одновременным внутрибрюшинным введением 0,4 мл 10% раствора реополиглюкина (300 мг/кг). Планиметрию поврежденной зоны проводили на 7, 14, 21 сутки. Экстракт в дозе 100 мг/кг и пасту в дозе 100 мг/кг (в пересчете на абсолютно сухое сырье) панцерии шерстистой вводили двум группам животных 1 раз в день перорально за час до инъекции уксусной кислоты, а затем ежедневно на протяжении 21 дня. Контрольная группа животных получала дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что экстракт панцерии оказывает антиальтеративное действие на всех сроках наблюдения, а фармакотерапевтическая эффективность настоя по данному критерию уступает действию экстракта.

Пример 2.

1 кг надземной части панцерии шерстистой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 0,5 мм (сито N 50, ГОСТ 214 – 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 15 л 53% этилового спирта в соотношении сырье : экстрагент 1 : 15 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 65^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 50% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Аналогично проводят и третью экстракцию в течение 60 минут. Первый слив – 11,25 л, второй слив – 9,6 л, третий – 9,5 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0,283 кг готового продукта, что составляет 28,3% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Полученный сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги – 5,93%.

Эксперименты по оценке влияния полученного экстракта на процессы экссудации были проведены на серых мышах линии F1(CBA x C57B1/6) с исходной массой 20,01,0 г. Серым мышам за 2 часа до субплантарной инъекции в правую заднюю конечность вводили 0,2 мл 3% раствора формалина, а затем через 5 часов и 18 часов после этого в желудок животных зондом вводили экстракт панцерии в дозах 100 мг/кг и 300 мг/кг. Другой группе крыс для сравнения в аналогичных условиях вводили настой панцерии в оптимально-терапевтической дозе 100 мг/кг (в пересчете на абсолютно сухое сырье). Контрольной группе вводили дистиллированную воду в равном объеме. Через 24 часа после введения формалина проводили оценку антиэкссудативного действия указанных средств онкометрическим методом. Данные исследований представлены в таблице 2. Из данных, приведенных в таблице 2, следует, что экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг оказывает выраженное антиэкссудативное действие. Увеличение дозы данного экстракта не приводит к существенному приросту регистрируемого эффекта.

Пример 3.

1 кг надземной части панцерии шерстистой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 0,5 мм (сито N 50, ГОСТ 214 – 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 16 л 50% этилового спирта в соотношении сырье : экстрагент 1 : 16 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 55^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 55% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Аналогично проводят и третью экстракцию в течение 60 минут. Первый слив – 12 л, второй слив – 10,28 л, третий – 10,15 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0,281 кг готового продукта, что составляет 28,1% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги 5%.

Опыты по влиянию экстракта панцерии на процессы пролиферации были проведены на 30 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200,010,0 г с подкожной имплантацией стерильных ватных тампонов по рекомендации Тринуса с соавторами / Тринус Ф.П., Мохорт Н.А., Клебанов В.Н. Нестеродные противовоспалительные средства. – Киев, – 1975. – 239 с./.

Стерильные ватные шарики массой 15 мг имплантировали под кожу крыс в области спины в асептических условиях. Экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг и настой панцерии в дозе 100 мг/кг (в пересчете на абсолютно сухое сырье), вводили животным перорально 1 раз в сутки в течение 7 дней. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в аналогичных объемах и режиме. На 8-е сутки у животных извлекали гранулемы и проводили взвешивание их в сыром виде и после высушивания при температуре 70^oC в течение 24 часов. По разности в массах гранулем у крыс, получавших экстракт и настой и животных, получавших дистиллированную воду, судили о влиянии испытуемых средств на фазу пролиферации. Полученные данные приведены в таблице 3. Из этих данных, можно заключить, что экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг не оказывает статистически значимого влияния на образование фиброзно-грануляционной ткани.

Таким образом, данные проведенных серий исследований свидетельствуют, что экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, оптимизируя течение воспалительной реакции, что очевидно обусловлено наличием в нем комплекса биологически активных веществ, в частности флавоноидов и других природных соединений.

На основании качественного фитохимического анализа суммы флавоноидов и экстрактивных веществ установлено наличие:
1) Флавоноидов:
двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки “Filtrak” FN – 12 в системах растворителей:
1 – бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5)
2 – уксусная кислота 15%.

При просматривании хроматограммы в УФ-свете до и после обработки 2% раствором алюминия хлорида обнаружены: рутин – Rf = 0,38 (1), Rf = 0,4 (2); кверцетин = Rf = 0,73 (1), Rf = 0,04 (2). Идентификацию проводили с аутентичными образами.

2) Фенолкарбоновых кислот:
двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системе растворителей: 1-н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5), 2 – 15% уксусная кислота.

После обработки хроматограммы в парах аммиака и просматривании в УФ-свете идентифицированы с аутентичными образцами:
кофейная кислота Rf = 0,79 (1), Rf = 0,53 (2).

хлорогеновая кислота Rf = 0,75 (1), Rf = 0,63 (2).

3) Дубильных веществ:
0,05 г полученного экстракта растворяют в 5 мл воды очищенной. К 2 мл полученного раствора добавляют 2 – 3 капли раствора железоаммониевых квасцов, появляется черно-синее окрашивание.

2. Количественное определение.

Сумма флавоноидов.

Аналитическую пробу измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстия 1 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 100 мл 50% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, аналогично проводят вторую и третью экстракцию 50 мл 50% этанола. После охлаждения объединенные извлечения доводят 50% спиртом до метки и перемешивают (р-ра А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл р-ра А и 1 мл 2% р-ра алюминия хлорида в 95% этаноле и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 минут измеряют оптическую плотность р-ра на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 95% спиртом до метки в мерной колбе на 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле
где
D – оптическая плотность испытуемого раствора;
D_о – оптическая плотность раствора ГСО рутина;
m – масса сырья в граммах;
m_о – масса ГСО рутина в граммах;
W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Примечание. Приготовление раствора ГСО рутина.

Около 0,5 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при T – 130-135^oC в течение 3 ч, растворят в 85 мл 95% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом, до метки и перемешивают.

Найдено 5,19% 0,048.

Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов и оздоровительных средств.

Для установления оптимальных технологических режимов были изучены основные факторы, влияющие на процессы экстрагирования растительного материала: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и кратность экстракций.

Количественная оценка велась по выходу суммы экстрактивных веществ /Государственная фармакопея. Т. 11, вып. 1, – 295 с./ и содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт. Метрологическая характеристика определения суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов проводилась на образцах панцерии шерстистой, собранной в окрестностях поселка Сокол, Бурятии в 1998 году (таблица 4).

Подбор оптимального экстрагента является одним из основных условий при получении извлечений. Экстрагент, действуя как активный компонент смеси, влияет на полноту, скорость и качество экстракции биологически активных веществ из растительного материала.

В качестве экстрагентов были использованы горячая вода (90 – 100^oC) и этиловый спирт следующих концентраций: 10, 20, 30, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 95.

На основании экспериментальных данных установлено, что оптимальным экстрагентом по выходу суммы экстрактивных веществ и флавоноидов выбран 50% этиловый спирт (таблица 5).

Нами проведено изучение зависимости выхода суммы флавоноидов и экстрактивных веществ, в зависимости от температуры экстракции в интервале температур от 20 до 100^oC. Результаты представлены в таблице 6.

На основании данных анализа установлено, что оптимальная температура экстракции 60 2,5^oC. Дальнейшее увеличение температуры нецелесообразно, поскольку возможно разрушение термолабильных веществ.

Общеизвестно влияние степени измельченности растительного материала, которое ведет к увеличению поверхности экстрагируемого материала за счет разрыва клеток, за счет которого происходит увеличение контакта между растворителем и материалом, вследствие чего ускоряется процесс экстракции.

Для изучения влияния степени измельченности растительного материала на выход суммы флавоноидов и экстрактивных веществ сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0. Результаты приведены в таблице 7.

Оптимальной степенью измельчения для сырья является размер частиц 0,5 мм.

Нами проведено изучение зависимости выхода суммы флавоноидов и экстрактивных веществ от соотношения сырье – экстрагент. Результаты исследования приведены в таблице 8.

С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций изучена зависимость времени достижения равновесной концентрации в системе сырье – экстрагент при трехкратной экстракции сырья. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 50% этиловым спиртом в соотношении 1 : 14 на водяной бане при температуре 60^oC при постоянном перемешивании с обратным холодильником.

Через заданные промежутки времени (30, 60, 90, 120 мин) извлечения фильтровали (1 контакт фаз), определяя сумму флавоноидов в пересчете на рутин и содержания экстрактивных веществ. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья при том же промежутке времени, добавляя каждый раз 50% этанол в количестве, равном объему слитого извлечения (2-ой и 3-ий контакт фаз), также анализировали на содержание суммы флавоноидов и экстрактивных веществ. Экспериментальные данные свидетельствуют, что равновесное состояние наступает при первом, втором и третьем контакте фаз через 60 минут (таблица 9).

В течение 1-го контакта фаз экстрагируется около 60 – 70% суммы флавоноидов и суммы экстрактивных веществ. Второй контакт обеспечивает выход около 25-30%, третий – около 5-10%, то есть для полноты истощения достаточно трехкратной экстракции.

Предлагаемый способ по сравнению с известным (таблица 10) позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой противовоспалительной активностью за счет увеличения содержания действующих веществ.

Посчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствует рациональному использованию лекарственного растительного сырья и открывают перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют лекарственное растение – панцерию шерстистую, которую экстрагируют 50 – 55% этиловым спиртом в соотношении растительный материал : экстрагент, равном 1 : 14 – 16, три раза по 60 мин при температуре 55 – 65^oС.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.10.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2003

Извещение опубликовано: 20.04.2003