Патент на изобретение №2325438
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BLP21 – ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА LYSPRO ЧЕЛОВЕКА
(57) Реферат:
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения высокоочищенного генно-инженерного инсулина Lyspro – быстродействующего аналога инсулина человека. Путем трансформации родительского штамма бактерий Escherichia coli BL21 плазмидной ДНК pLP-3-1 получают штамм Escherichia coli BLP21 – продуцент проинсулина Lyspro. Изобретение позволяет получить стабильный рекомбинантный инсулин Lyspro с высоким выходом и по упрощенной технологии. 1 ил.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения высокоочищенного генно-инженерного инсулина Lyspro, применяемого при изготовлении лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета. Известен штамм Escherichia coli K12 RV308/pRB172 – продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro человека, в котором ген этого аналога проинсулина, кодирующий полипептид с двумя избыточными N-концевыми аминокислотными остатками Met-Tyr, находится в экспрессирующей векторной плазмиде под контролем промотора pL и температурочувствительного репрессора с1857 фага Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм-продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro человека Е.coli pLP-3-1/TG-1, в котором рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, соединенный через пептидный линкер с аминокислотной последовательностью домена В стафилококкового белка А, введена в клетки Е.coli TG-1 дикого типа. Индукция экспрессии рекомбинантного гена в этом штамме осуществляется с использованием изопропил- Изобретение решает задачу расширения ассортимента высокопродуктивных штаммов-продуцентов, позволяющих получать быстродействующий инсулин Lyspro с высоким выходом и по упрощенной технологии. Поставленная задача решается путем создания штамма бактерий Е.coli BLP21 – продуцента рекомбинантного проинсулина Lyspro, содержащего плазмидную ДНК pLP-3-1. Штамм получают трансформацией плазмидной ДНК pLP-3-1 клеток Е.coli BL21. Трансформантов отбирают на селективной агаризованной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, по резистентности к антибиотику, т.е. способности к росту в его присутствии. Плазмида pLP-3-1 является рекомбинантной, содержит искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus, пептидного линкера His6GlySerArg и проинсулина Lyspro человека, гибридный tac-промотор и терминатор рибосомного оперона E.coli, a также ген bla, кодирующий Штамм Е.coli BLP21 имеет следующие характеристики. Культурально-морфологические признаки. Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует. Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты. Генетические признаки. F– ompT hsdSB(rB – mB –) gal dcm. Проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLP-3-1. Условия хранения штамма. Штамм бактерий Escherichia coli BLP21 хранят на чашках и косяках при 4°С. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в среде LB, содержащей 30% глицерин, при -20-70°С. Устойчивость к антибиотикам. Клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLP-3-1. Преимуществом полученного штамма Е.coli BLP21 перед штаммом-продуцентом прототипа является повышение стабильности рекомбинантного проинсулина Lyspro человека как следствие неактивного состояния генов lon и ompT, кодирующих соответственно АТР-зависимую протеиназу и протеиназу внешней мембраны бактериальных клеток. В результате, в клетках нового штамма отсутствуют продукты протеолиза предшественника инсулина, что позволило упростить процесс очистки конечного продукта и повысить выход очищенного генно-инженерного инсулина Lyspro. Изобретение иллюстрирует пример. Пример Штамм бактерий Е coli BLP21 создают путем введения ДНК плазмиды pLP-3-1 с помощью электропорации в компетентные клетки E coli BL21. Исходный штамм Е.coli BL21 F– ompT hsdSB(rB – mB –) gal dcm получен из музея ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г.Москва). Компетентные бактериальные клетки получают в соответствии со стандартной методикой. Плазмидную ДНК pLP-3-1, кодирующую аминокислотную последовательность проинсулина Lyspro человека, выделяют из штамма-продуцента Е.coli pLP-3-1/TG-1 [патент РФ №2235776] стандартным щелочным методом (Maniatis, Т., Fritsch, Е.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) и используют для введения в компетентные клетки Е.coli BL21 с помощью электропорации [пат. РФ №2267534, МКИ, 2004]. Клетки нескольких бактериальных колоний, выросших на чашках в присутствии ампициллина, далее выращивают в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и хранят в пластиковых ампулах при -70°С в той же среде, содержащей 30% глицерин. В полученном бактериальном штамме E.coli BL21/pLP-3-1 (BLP21) определяют эффективность биосинтеза рекомбинантного проинсулина Lyspro человека.
Формула изобретения
Штамм бактерий Escherichia coli BLP21 – продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro, содержащий плазмидную ДНК pLP-3-1.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) при нормальной температуре [пат. РФ №2235776, МКИ C12N 15/17, опубл 2003]. Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза рекомбинантного белка, и он лишен недостатков штамма с термоиндуцибельным рекомбинантным геном. Однако очистка гибридного белка, получаемого из клеток этого штамма в виде телец включения, и конечного продукта, инсулина Lyspro, также затруднена из-за присутствия продуктов протеолиза, что значительно уменьшает выход инсулина Lyspro и повышает его себестоимость.