Патент на изобретение №2325185

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВИРУС-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и предназначено для получения живых культуральных вирусвакцин против чумы мелких жвачных животных. Способ получения сухой культуральной вирус-вакцины против чумы мелких жвачных животных включает выращивание вируссодержащего сырья из штамма «45G37/35-K» вируса чумы мелких жвачных в культуре клеток, добавление защитной среды и получение целевого продукта, причем в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток почки сайги, инфицированную вирусом культуру инкубируют в роллерных условиях в течение 5-7 суток со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 суток культивирования, вируссодержащее сырье перед лиофилизацией смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, затем лиофилизируют до содержания массовой доли влаги не более 4% и расфасовывают в ампулы. При этом получают целевой продукт, содержащий вируссодержащее сырье, пептон, сахарозу, желатин и деминерализованная воду. Изобретение обеспечивает получение стандартной, безвредной, стабильной при хранении вирус-вакцины против чумы мелких жвачных по высокопроизводительной технологии. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к способам получения живых культуральных вирус-вакцин против чумы мелких жвачных животных, и может использоваться на предприятиях биологической промышленности.

Для изготовления вакцин используется вируссодержащее сырье, полученное при культивировании в статических, вращающихся культуральных сосудах или в суспензии в реакторе (1).

При изготовлении вирус-вакцины против чумы мелких жвачных животных используется вируссодержащее сырье, полученное в монослое клеток Vero (2) или первичной культуре клеток почки ягненка (3).

Наиболее близким аналогом предполагаемого изобретения является способ получения вирус-вакцины в стационарном монослое первичной культуры клеток почки ягненка (ПЯ), включающий: выращивание культуры клеток ПЯ в стационарном монослое, получение вирусного сырья в монослойной культуре клеток ПЯ, лиофилизацию вируса со стабилизатором (конечная концентрация по массе – %) 10 – пептона, 2 – лактозы (4).

Способ осуществляется следующим образом: культуру клеток ПЯ, выращенную в стационарном монослое в матрасах вместимостью 1,0 или 1,5 дм³, заражают штаммом «45G37/35-K» в дозе 0,001-0,01 ТЦД₅₀/см³. В качестве ростовой среды для клеток применяют среду Игла MEM с 5,0% сыворотки крови КРС, а в качестве поддерживающей – среду Игла MEM с 2,0% сыворотки КРС и антибиотиками. Культивирование вируса проводят в течение 5-7 сут при температуре (37,0±0,5)°С. Лиофилизацию технической жидкости, состоящей из вируссодержащего сырья и стабилизатора, включающего (конечная концентрация по массе – %) 10 – пептона, 2 – лактозы, проводят в соответствии с регламентом по изготовлению и контролю вирус-вакцины. Титр вакцинного вируса в сухом препарате составляет не менее 10^4,5 ТЦД₅₀/см³.

Недостатком известного способа в современных условиях производства является использование технологии, предусматривающей получение вируссодержащего сырья в первичной культуре клеток почки ягнят. Получение клеточного субстрата связано с сезонностью, возможностью контаминации его эндогенными контаминантами и нерентабильным использованием молодых ягнят, что приводит к большим затратам на получение промышленных серий культуры клеток и повышает себестоимость препарата.

Целью изобретения является разработка способа получения вирус-вакцины против чумы мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) сухой культуральной, обладающей высокой иммуногенной активностью и стабильностью при хранении.

Поставленная цель достигается тем, что при предлагаемом способе изготовления вирус-вакцины против ЧМЖЖ в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток почки сайги (ПС), инфицированную вирусом культуру инкубируют в роллерных условиях в течение 5-7 суток со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 суток культивирования, вируссодержащее сырье перед лиофилизацией смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, затем лиофилизируют до содержания массовой доли влаги не более 4% и расфасовывают в ампулы. По предлагаемому способу получают целевой продукт следующего состава, мас.%:

Способ осуществляют следующим образом. Получают перевиваемые клетки почки сайги в роллерных сосудах вместимостью 3,0 дм³ при посевной концентрации 100,0-120,0 тыс.клеток в см³, скорости вращения сосудов 10-12 об/ч, объеме их заполнения 0,5 дм³, температуре выращивания 37,0±0,5°С в течение 48-72 часов; инфицируют сформированный монослой посевным вирусом в дозе 0,001-0,01 ТЦД₅₀/клетку, инкубируют инфицированную культуру клеток в указанных условиях в течение 6-7 суток со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 суток культивирования; замораживают пораженную на 75,0-80,0% культуру клеток при минус 40°С и оттаивают при комнатной температуре; смешивают полученное вируссодержащее сырье с защитной средой (конечная концентрация, % по массе) пептона – 10,0, сахарозы – 5,0, желатины – 1,0, деминерализованной воды – остальное в объемном соотношении 1:1 и проводят лиофильное высушивание до содержания массовой доли влаги не более 4,0%.

Предлагаемый способ отличается от известного тем, что для выращивания вируса используется перевиваемая культура клеток почки сайги (депонирована во ВНИИВВиМ в 1991 г., кат. №31.1) и штамм «45G37/35-К», адаптированный к указанной культуре клеток. Клетки ПС эпителиодного типа полигональной формы со стабильным кариотипом. Модальный класс представляют клетки с 50 хромосомами, что составляет 40,0%. Выращивают клетки в стационарной культуре клеток ПЯ в среде Игла MEM с 5,0% сыворотки КРС. Использование указанной клеточной культуры позволяет исключить из технологического процесса дорогостоящую первичную культуру клеток почки ягненка и развернуть производство препарата в различные периоды года.

Другим отличием предлагаемого способа от прототипа является использование более производительной роллерной технологии культивирования вируса, что позволяет получить вирусного сырья за один цикл культивирования по сравнению со стационарным в 2,0-2,5 раза больше, чем при стационарном монослое.

В качестве защитной среды используется среда следующего состава с исходной концентрацией (% по массе): пептона – 20,0, сахарозы – 10,0, желатины – 2,0, деминерализованной воды – остальное.

При реализации предлагаемого способа получения вирус-вакцины против чумы мелких жвачных животных используют вируссодержащее сырье с биологической активностью не ниже 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ и защитную среду в объемном соотношении 1:1, что обеспечивает следующее содержание защитных веществ (конечная концентрация – % по массе): пептона – 10,0; сахарозы – 5,0 и желатины – 1,0. Предлагаемая защитная среда обеспечивает минимальные потери титра вируса при лиофилизации (не более 0,5 lg) и стабильность физических и иммунобиологических свойств вирус-вакцины.

Пример 1. Адаптация вируса ЧМЖЖ к перевиваемой культуре клеток.

Адаптацию вируса к перевиваемой культуре клеток проводят путем инокуляции ее вакцинным штаммом «45G37/35-K», полученным в первичной культуре клеток ПЯ (первый пассаж), а в последующих пассажах – материалом предыдущего. Инфицированную культуру клеток инкубируют при 37,0°С в течение 6-9 суток. О размножении вируса в клетках судили по проявлению цитопатического действия. На уровне 3-го пассажа специфическую дегенерацию у 30-40% инфицированных клеток отмечают на 4-5 сутки, титр вируса на 8-9 сутки составляет 4,0-4,5 lg ТЦД₅₀/см³. Репродукция вируса в 6-7 пассажах характеризуется специфическими дегенеративными изменениями, появление которых отмечают на 2-3 сутки, и накопление вируса составляет 5,0-5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Пример 2. Получение вируссодержащего сырья.

Для получения вируссодержащего сырья используют культуру клеток ПС, выращенную на среде Игла MEM с 5,0% сыворотки крови КРС в роллерных сосудах.

Оптимальным режимом культивирования вируса на роллерной установке в бутылях вместимостью 3,0 дм³ являются следующие параметры: множественность заражения 0,001-0,01 ТЦД₅₀/клетку, содержание сыворотки 2,0% в поддерживающей среде, скорость вращения роллерных сосудов 10-12 об/мин, смена питательной среды через каждые 2 суток культивирования, продолжительность культивирования 7 суток. Содержимое роллерных сосудов замораживают при минус 40°С и оттаивают при комнатной температуре. Накопление вируса составляет 5,5-6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Вируссодержащее сырье до лиофилизации хранят при 4,0°С или минус 40°С в течение 3 или 6 месяцев соответственно.

Пример 3. Изготовление вирус-вакцины и контроль биологических показателей

К 50 л вируссодержащего сырья добавляют, при постоянном перемешивании, 50 л защитной среды, содержащей в конечной концентрации (% по массе) пептона – 10,0; сахарозы – 5,0, желатина 1,0 и деминерализованной воды – остальное. К полученной смеси добавляют комплекс антибиотиков и лиофилизируют до содержания массовой доли влаги не более 4%, затем расфасовывают по 1,0 см³ в ампулы вместимостью 5,0 см³.

Инфекционная активность

При титровании вирус-вакцины в монослойной культуре клеток ПС активность по сериям составила: серия №1 – 5,5 lg ТЦД₅₀/см³ и серия №2 – 4,75lgТЦД₅₀/см³.

Безвредность

При введении препарата ягнятам и кроликам по 1,0 см³ (по 3 головы на серию) все животные остались клинически здоровыми в течение 21 сут наблюдения.

Иммуногенная активность

Иммуногенную активность вирус-вакцины 1 и 2 серий проверяли по титру ВН-антител.

У овец через 21 сут после вакцинации были взяты пробы крови для определения уровня сывороточных антител в реакции нейтрализации (РН). РН ставили в перевиваемой культуре клеток ПС методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса. В реакции использовали штамм «45G37/35-K» вируса ЧМЖ, адаптированный к культуре клеток ПС. В сыворотках крови иммунизированных овец были выявлены вируснейтрализующие антитела в защитных титрах от 1:8 до 1:16.

Оптимальной температурой хранения вирус-вакцины является температура 4,0°С и минус 40°С, при которых препарат сохраняет исходные свойства в течение 12 и 24 мес соответственно.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение по разработанной высокопроизводительной технологии безвредную, высокоиммуногенную, стабильную при хранении вирусвакцину против чумы мелких жвачных животных сухую культуральную. Он прост в исполнении, доступен и может быть реализован в промышленном масштабе.

Источники информации

1. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. 1993 г.

2. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines: list A and В discases of mammals, birds and bees. Office international des Epizooties (OIE) world organization for Animal health. 2000. P.114-122.

4. Патент RU 2284193 С1 от 27.09.2006 г. Сухая культуральная вирус-вакцина против чумы мелких жвачных животных.

Формула изобретения

1. Способ получения сухой культуральной вирус-вакцины против чумы мелких жвачных животных, включающий выращивание вируссодержащего сырья из штамма «45G37/35-K» вируса чумы мелких жвачных в культуре клеток, добавление защитной среды и получение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток почки сайги, инфицированную вирусом культуру инкубируют в роллерных условиях в течение 5-7 сут со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 сут культивирования, вируссодержащее сырье перед лиофилизацией смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, затем лиофилизируют до содержания массовой доли влаги не более 4% и расфасовывают в ампулы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают целевой продукт следующего состава, мас.%:

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.01.2009

Извещение опубликовано: 20.02.2010 БИ: 05/2010

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.06.2010

Извещение опубликовано: 10.06.2010 БИ: 16/2010