Патент на изобретение №2325172
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СОРБЕНТ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и служит для связывания иммуноглобулинов различных подклассов из плазмы крови человека. Предложен сорбент для удаления иммуноглобулинов из плазмы крови человека, который содержит агарозную матрицу, ковалентно связанную с лигандом. При этом в качестве лиганда он содержит F(ab)2 фрагменты специфических аффинно-очищенных поликлональных антител барана против иммуноглобулинов G человека. Сорбент, представляющий собой биологически инертную, биосовместимую агарозную матрицу. Сорбент обладает большей сорбционной емкостью и безопасностью иммуносорбентов, используемых в практических целях, в частности в процедурах терапевтического афереза по сравнению с известными сорбентами на основе поликлональных антител. При его использовании существенно снижается возможный иммунологический ответ организма человека на чужеродный белок. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и служит для связывания иммуноглобулинов различных подклассов из плазмы крови человека и других биологических жидкостей, а также может использоваться в биохимии и биотехнологии для извлечения специфических компонентов из белковых растворов. Существует целый ряд неврологических, гематологических, системных аутоиммунных заболеваний, развитие которых сопровождается образованием и накоплением в крови больного аутоантител к различным антигенам собственного организма. Показано, что аутоантитела являются важным звеном патологического процесса при таких заболеваниях как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура [1], синдромы Гильена-Барре или Гудпасчера, миастения, дилатационная кардиомиопатия [2, 3] отторжение трансплантантов, иммунный конфликт при беременности и др. Во многих случаях, когда лекарственная терапия не эффективна или не может быть применена, удаление иммуноглобулинов (Ig аферез) из кровотока пациента позволяет существенно улучшить качество жизни пациента и прогноз болезни [4, 5, 6, 7]. Любая сорбционная колонка медицинского назначения состоит из трех основных компонентов: матрицы – биологически инертного биосовместимого материала; лиганда-молекул, которые ковалентно присоединяются к матрице и придают сорбенту специфичность, и корпуса колонки, куда помещается сорбент. Для колонок, используемых в клинике, наиболее важными параметрами являются – эффективность и специфичность удаления патогенного компонента или компонентов, а также безопасность использования колонок в процедуре терапевтического афереза. Эффективностью удаления патогенного компонента принято называть снижение (в %) концентрации этого компонента за хроматографический цикл или процедуру. Эффективность сорбционной колонки определяется сорбционной емкостью сорбента, объемом геля в колонке и возможностью многократного использования колонки в течение одной процедуры. В настоящее время в клинической практике для Ig афереза наиболее широко применяют сорбенты с иммобилизованными поликлональными антителами к иммуноглобулинам человека («Ig Адсопак»®, НПФ «ПОКАРД», Россия; «Ig Therasorb»®, «Miltenyi Biotec»®, Германия) [7, 8], колонки с иммобилизованным белком A («Immunosorba»® и «Prosorba»®, «Fresenius HemoCare», Германия). Недавно создан сорбент с синтетическим олигопептидом «Globaffin» «Affinna», Германия. Колонки «Immunosorba»® содержат 62,5 мл геля агарозы с иммобилизованным белком А. Сорбционная емкость такого сорбента составляет приблизительно 20 мг IgG /мл геля сорбента [9]. Колонки разработаны для многократного применения в течение процедуры. Основным недостатком сорбента является избирательное взаимодействие белка А с различными подклассами IgG [10], что достоверно снижает клинический результат при лечении ряда заболеваний, в частности ДКМП [11]. Сорбент с иммобилизованным белком А снижал концентрацию IgM и IgA на 20-40%, что в два раза менее эффективно чем иммуносорбенты на основе антител [12]. Аналогичный лиганд – белок А используется в колонках «Prosorba»®, «Fresenius HemoCare», Германия, которые содержат 300 мл сорбента на основе силикагеля. Сорбционная емкость сорбента из колонки «Prosorba»® составляет 7,1±1,8 мг IgG/мл геля [13]. Кроме вышеописанных недостатков, определяемых иммобилизованным белком А, в опытах in vitro и при клиническом использовании была отмечена утечка лиганда с носителя [14, 15]. Тот факт, что колонки «Prosorba»® разработаны для однократного применения и, следовательно, не регенерируются и не подлежат повторному терапевтическому использованию, является другим немаловажным недостатком таких колонок [15, 16], поскольку это обстоятельство существенно ограничивает эффективность колонок при проведении процедуры терапевтического афереза. Колонки с иммобилизованным пептидом, способным связывать иммуноглобулины G «Globaffin» («Fresenius», Германия), содержат 67 мл агарозного геля с иммобилизованным пептидом PGAM146. Колонки «Globaffin» удаляют широкий спектр иммуноглобулинов человека и разработаны для многократного применения. Сорбционная емкость сорбента составляет в среднем 17 мг IgG/мл геля [17]. Поскольку использование таких колонок только начинается в рамках клинических испытаний, в литературе практически отсутствуют данные о достоинствах и недостатках такого сорбента. Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является сорбент на основе агарозной матрицы с иммобилизованными поликлональными антителами барана против IgG человека, который используется в колонках «Ig Therasorb»®, (Myltenyi Biotec GmbH, Германия), содержащих 150 мл агарозного геля с иммобилизованными поликлональными антителами барана против IgG человека. Сорбционная емкость сорбента составляет в среднем 12 мг IgG/мл геля. Колонки предусмотрены для многократного применения и регенерации в течение процедуры терапевтического афереза, связывают все подклассы иммуноглобулинов класса G, а также частично иммуноглобулины классов А и М. Основным недостатком данного сорбента является сорбционная емкость, на 30% уступающая сорбенту с иммобилизованным белком А (см. таблицу). Прототипом настоящего изобретения является сорбент, используемый в колонках «Ig Адсопак»®, (НПФ «ПОКАРД», Россия), содержащих 200 мл агарозного геля с иммобилизованными поликлональными антителами барана к IgG человека. Сорбционная емкость 1 мл геля составляет в 10-12 мг белка иммуноглобулинов [18]. Колонки эффективно удаляют IgM и IgA [19], рассчитаны на многократное применение и выдерживают до 100 циклов сорбции десорбции с потерей сорбционной емкости, не превышающей 30%. Иммуносорбенты, содержащие в качестве лиганда поликлональные антитела барана к IgG человека, не имеют вышеописанных недостатков, присущих сорбентам с иммобилизованным белком А, а именно: низкое связывание IgG 3 подкласса, слабое взаимодействие с IgM и IgA. Однако они уступают последнему по своей сорбционной емкости. Задача данного изобретения – повысить сорбционную емкость и безопасность иммуносорбентов, используемых в практических целях, в частности в процедурах терапевтического афереза. Данная задача решается использованием в качестве лиганда F(ab)2 фрагментов антител, иммобилизованных на матрицу в концентрации, обеспечивающей заданную сорбционную емкость. Несмотря на известность F(ab)2 фрагментов IgG с 60-ых годов прошлого века [20], в литературе отсутствуют данные об их использовании в качестве лигандов при синтезе иммуносорбентов, нашедших практическое применение в области терапевтического афереза. Вероятно, это объясняется тем, что попытки получения сорбентов с иммобилизованными не модифицированными F(ab)2 фрагментами не приводили к желаемому результату – не позволяли повысить сорбционную емкость сорбента [21]. Таким образом, использование F(ab)2 фрагментов антител для получения иммуносорбентов, используемых в практических целях, является неочевидным для специалистов в данной области. Предложенный сорбент представляет собой биологически инертную, биосовместимую агарозную или целлюлозную матрицу, ковалентно связанную с F(ab)2 фрагментами специфических, аффинно-очищенных поликлональных антител барана против иммуноглобулинов G человека. Ковалентная связь между лигандом и матрицей образуется после активации матрицы такими реагентами как бромциан или метапериодат натрия. В качестве лиганда могут быть использованы F(ab)2 фрагменты аффинно-очищенных поликлональных или моноклональных антител различной специфичности. Основным преимуществом предлагаемого сорбента является достоверно большая по сравнению с прототипом сорбционная емкость (15,8±1,0 мг IgG/ мл геля для сорбента с иммобилизованными F(ab)2 фрагментами поликлональных антител против иммуноглобулинов G человека и 11,2±0,8 мг IgG/мл геля для прототипа) с сохранением всех вышеописанных преимуществ иммуносорбентов с антителами, как то: высокая специфичность, взаимодействие со всеми классами и подклассами иммуноглобулинов, возможность многоразового использования. Кроме того, отсутствие в составе лиганда константной области тяжелых цепей иммуноглобулинов, обуславливающих межвидовые различия иммуноглобулинов (изотипические антигенные датерминанты), существенно снижает потенциально возможный иммунологический ответ организма человека на чужеродный белок, таким образом, повышает безопасность применения иммуносорбента для целей терапевтического афереза. Сопоставление заявляемого сорбента с литературными данными аналогов и прототипа приведены в таблице, там же содержатся собственные данные сравнения сорбционной емкости предлагаемого сорбента с коммерчески доступными аналогами и прототипом. Осуществление изобретения Пример. Антисыворотку барана к иммуноглобулинам человека получали иммунизацией животных-доноров иммуноглобулинами G человека, очищенными ионообменной хроматографией в соответствии с описанным авторами ранее способом [18]. Специфические антитела барана к иммуноглобулинам человека получали методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным антигеном – иммуноглобулинами G человека [18]. Фрагменты специфических антител получали методом протеолитического расщепления препарата поликлональных антител барана к IgG человека на колонке с иммобилизованным ферментом пепсином («Pierce», США). Для получения специфических F(ab)2 фрагментов антител аффинно-очищенные поликлональные антитела барана в цитратном буфере рН 2,5 с концентрацией 10 мг/мл пропускали через колонку с 2 мл сорбента с пепсин-агарозой. Время контакта раствора антител с иммобилизованным ферментом составляло 4 мин. Количество антител, используемых в реакции ферментативного расщепления, варьировали от 0,1 до 7,0 г. Исследование препаратов антител после расщепления методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (градиент 4-22%) в денатурирующих условиях показало наличие мажорной полосы, соответствующей F(ab)2 (100 кДа), а также минорных полос с молекулярной массой от 10 до 50 кДа, соответствующих фрагментам расщепления константной области (Fc фрагмента) молекулы иммуноглобулинов. Выделение иммуноактивных F(ab)2 фрагментов антител к иммуноглобулинам человека проводили методом аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным на агарозную матрицу антигеном – иммуноглобулинами G человека. Хроматографию проводили при значениях рН не ниже 4,5, время нанесения фрагментированных антител на колонку составляло 2 часа. Элюцию активных F(ab)2 фрагментов проводили цитратным буфером рН 2,5. Присутствие активных F(ab)2 фрагментов определяли методом ИФА. На плашке первым слоем были сорбированы иммуноглобулины G человека, вторым слоем – раститрованные F(ab)2 фрагменты антител, в качестве детектирующих антител использовали антитела кролика к иммуноглобулинам барана, конъюгированные с пероксидазой. Полученные элюаты концентрировали до 10-15 мг/мл и иммобилизовали на предварительно активированную агарозную матрицу, для чего в раствор F(ab)2 фрагментов, диализованных против воды (рН 4,0-4,5) добавляли 10-кратный карбонатный буфер рН 10,0 и инкубировали в течение 2 часов с предварительно активированной бромцианом агарозной матрицей. Концентрацию иммобилизованного лиганда оценивали дифференциальным способом по разнице в количестве белка, взятого для проведения реакции иммобилизации и оставшегося в растворе после окончания инкубации с матрицей. Результат. Сорбционную емкость предлагаемого сорбента, прототипа и коммерческих аналогов тестировали методом аффинной хроматографии с плазмой крови человека, с концентрацией иммуноглобулинов G 15 мг/мл. Хроматографию проводили на 100 мкл сорбента, время контакта сорбента с плазмой составляло 1 час, объем плазмы 1 мл. После окончания инкубации сорбенты промывали 5 мл фосфатного буфера, а связавшийся белок элюировали 2 мл 0,05М цитратного буфера рН 2,5. Сорбционная емкость заявляемого сорбента (количество белка в элюате с 1 мл геля) варьировалась от 14,3 до 17,8 мг/мл. Результаты собственных исследований авторов по сорбционной емкости предлагаемого сорбента, аналогов и прототипа приведены в таблице. Специфичность, т.е. способность специфически связывать иммуноглобулины G из смеси белков (плазмы крови человека), подтверждена тестированием элюата с сорбента методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля в денатурирующих условиях. Элюат с предлагаемого сорбента содержит не менее 90% иммуноглобулинов G и практически не содержит примеси других белков плазмы. 1 мл сорбента с иммобилизованными F(ab)2 фрагментами поликлональных антител к иммуноглобулинам человека связывает 6,9 мг IgM и 3,3 мг IgA из плазмы с исходным уровнем данных иммуноглобулинов 2,6 и 2,8 мг/мл соответственно. 20 хроматографических циклов с плазмой крови человека приводят к падению сорбционной емкости сорбента с иммобилизованными F(ab)2 фрагментами антител к иммуноглобулинам G человека на 7%, тогда как падение сорбционной емкости за 100 циклов не превышает 30%, что позволяет эффективно использовать предлагаемый сорбент многократно.
Список источников информации
11. Staudt A., Bohm M., Knebel F., Grosse Y., Bischoff C., Hummel A., Dahm JB., Borges A., Jochmann N., Wernecke KD., Wallukat G., Baumann G., Felix SB. Potential role of autoantibodies belonging to the immunoglobulin G-3 subclass in cardiac dysfunction among patients with dilated cardiomyopathy. / Circulation. – 2002. – V.106 (19). – P.2448-2453. 2 fragments. / Journal of Biochemical Methods. – 1992. – V.25. – P.285-297.
Формула изобретения
Сорбент для удаления иммуноглобулинов из плазмы крови человека, содержащий агарозную матрицу, ковалентно связанную с лигандом, отличающийся тем, что в качестве лиганда он содержит F(ab)2 фрагменты аффинно-очищенных поликлональных антител барана против иммуноглобулинов G человека.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. / Circulation. – 1994. – V.89. – P.2760-2767.