Патент на изобретение №2324943
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПО СОДЕРЖАНИЮ В КРОВИ ВЕЩЕСТВ НИЗКОЙ И СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии. Сущность способа заключается в том, что сыворотку крови освобождают от высокомолекулярных белков кипячением с последующим центрифугированием, затем выполняют спектрофотометрирование водного раствора супернатанта в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм, после чего производят расчет оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы. На основании полученных спектров вычисляют оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы в сыворотке крови (
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для определения эндогенной интоксикации при различных заболеваниях, сопровождающихся патологическим белковым катаболизмом и развитием токсических состояний. Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы. Известен способ определения эндогенной интоксикации, включающий разведение 0,1 мл сыворотки крови 0,9 мл физиологического раствора перед проведением депротеинезации, осаждение белков путем прибавления к полученному раствору 0,5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, разведение полученного супернатанта в десять раз дистиллированной водой и измерение оптической плотности полученного раствора на длине волны 254 нм. О наличии эндогенной интоксикации судят по величине оптической плотности, полагая, что для практически здоровых людей Данный способ включает осаждение высокомолекулярных белков из исследуемой жидкости 10% раствором трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием (3000 об/мин, 20 минут) и определением коэффициента поглощения света разведенной в 10 раз надосадочной жидкостью. Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны света 254 и 280 нм против дистиллированной воды. Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в исследуемой жидкости характеризуют величиной оптической плотности, так как согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра величина оптической плотности раствора поглощающих центров пропорциональна их концентрации. По значениям оптической плотности при длинах волн 254 и 280 нм и судят о наличии эндогенной интоксикации. Этот способ страдает рядом недостатков: 1) Наличие в надосадочной жидкости неконтролируемого остаточного количества трихлоруксусной кислоты вносит погрешность в определение концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы при измерении на длине волны 254 нм против дистиллированной воды. 2) Условие пропорциональности между оптической плотностью и концентрацией поглощающих центров (закон Бугера-Ламберта-Бэра) выполняется только для однокомпонентного раствора. В многокомпонентной системе, какой является сыворотка крови, пропорциональность между оптической плотностью и концентрацией веществ низкой и средней молекулярной массы зависит не только от их суммарного содержания, но и от хромофорного состава веществ низкой и средней молекулярной массы. Поэтому при некоторых заболеваниях наличие эндогенной интоксикации не приводит к заметному изменению оптической плотности супернатанта на длинах волн 254 или 280 нм. 4) Существенным недостатком известного способа является также и то, что в качестве оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы используют величину оптической плотности. Величина оптической плотности зависит не только от концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы, но и условий проведения измерений (толщина и качество применяемых кювет, спектральное разрешение, погрешность и динамический диапазон используемого спектрофотометра), что сказывается на результатах определения эндогенной интоксикации. Задачей изобретения является получение нового технического результата, заключающегося в повышении чувствительности и достоверности способа определения эндогенной интоксикации за счет устранения основных недостатков известного способа, а именно за счет создания условий для расширения диапазона спектрофотометрирования в сторону коротких длин волн до 200 нм с включением в анализ диагностически наиболее информативной области от 200 до 230 нм, характерной для пептидной связи. Поставленная задача решается тем, что сыворотку крови освобождают от высокомолекулярных белков кипячением с последующим центрифугированием, затем выполняют спектрофотометрирование водного раствора супернатанта в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм, после чего производят расчет оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле:
где Dх(
По величине оценочного показателя В частности, при определении эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом кипячение сыворотки крови проводят в течение 3 минут при температуре 100°С и центрифугируют в течение 5 минут при 6000 об/мин, затем супернатант разводят дистиллированной водой и спектрофотометрируют его в диапазоне длин волн от 200 до 230 нм, после чего оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы вычисляют по формуле:
и при значении оценочного показателя В отличие от известного способа, в заявляемом способе осаждение высокомолекулярных белков осуществляют кипячением с последующим центрифугированием, а не путем обработки сыворотки крови трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием. Отсутствие в супернатанте следовых количеств трихлоруксусной кислоты позволяет расширить диапазон спектрофотометрирования с 250-330 до 200-330 нм. Замена способа депротеинизации сыворотки крови позволяет исключить влияние концентрации и трудно учитываемых физико-химических свойств препаратов трихлоруксусной кислоты на величину оптической плотности растворов супернатанта. В результате повышается точность определения содержания веществ низкой и средней молекулярной массы в сыворотке крови. С целью определения эффективности осаждения высокомолекулярных белков кипячением сыворотки крови нами были проведены исследования супернатанта из сыворотки крови донора и больного деструктивным панкреатитом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Из хроматограммы, где по оси Х отмечена молекулярная масса, а по оси Y – интенсивность пика (см. чертеж) видно, что как в супернатанте из сыворотки крови донора (1), так и в супернатанте из сыворотки крови больного деструктивным панкреатитом (2), содержание фракции веществ с молекулярной массой менее 10000 дальтон составляет от 60 до 80%. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективность применяемой методики осаждения белка. Важным отличием способа является введение нового оценочного показателя Интервал интегрирования по длинам волн выбирают исходя из значений оптической плотности супернатанта в доступном спектрофотометрированию и наиболее информативном при конкретном заболевании диапазоне. В известном способе содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в крови характеризуют значением оптической плотности при фиксированной длине волны в спектре поглощения раствора супернатанта из образца сыворотки крови. В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бэра и свойством аддитивности спектров поглощения, величина оптической плотности раствора будет зависеть от условий проведения измерения (толщина и спектральные свойства кювет) и хромофорного состава основных компонентов входящих в пул веществ низкой и средней молекулярной массы:
где Cj – молярная концентрация j-го хромофора; l – толщина кюветы. Из приведенного выражения следует, что в известном способе на заключение о наличии эндогенной интоксикации оказывают влияние условия проведения измерений и тип заболевания. В заявляемом способе применение оценочного показателя Справедливость этого утверждения следует из того, что выражение для вычисления оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы можно преобразовать к виду, с полной очевидностью не зависящему от свойств применяемых кювет и длины волны измерения оптической плотности:
где
Таким образом, применение интегральных значений оптической плотности позволяет определить процент превышения содержания веществ низкой и средней молекулярной массы с точностью до незначительной разницы в хромофорном составе пула веществ низкой и средней молекулярной массы (если хромофорный состав меняется незначительно, то Заявленный способ не очевиден для специалистов, работающих в данной области. Метод определения эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы известен и применяется давно, но никто из специалистов в данной области не использовал для осаждения крупномолекулярных белков сыворотки крови термический способ. Кажущаяся простота такого решения на самом деле потребовала длительных экспериментов в связи с высокой ответственностью получения значимых для диагностики и лечения результатов. Неочевидность способа связана с точкой зрения, что необходимо осаждать крупномолекулярные белки сыворотки крови исключительно неорганическими кислотами. Нами впервые применен способ депротеинизации, который позволил устранить погрешности, связанные с содержанием в опытных образцах остатка неорганических кислот. Ценность такого нового подхода убедительно обоснована высокоэффективной жидкостной хроматографией. Отсутствие в опытных образцах остатка неорганических кислот позволяет в диагностике эндогенной интоксикации использовать наиболее информативную область спектра 200-230 нм, характерную для пептидных связей низкомолекулярных веществ. Нами впервые в заявленном способе применен новый количественный показатель Для заявляемого способа характерны повышенная точность диагностики, а также стабильность и сопоставимость результатов исследования, что крайне важно для лечения данной группы больных. Показатель эндогенной интоксикации является основным критерием для определения прогноза, тяжести и исхода заболевания, а также выбора экстракорпоральных методов детоксикации. Найденное техническое решение явилось результатом длительных поисков и экспериментов и в какой-то мере оказалось для нас неожиданно. В настоящее время заявленный способ является способом выбора в определении веществ низкой и средней молекулярной массы для диагностики эндогенной интоксикации, в частности у больных хирургического профиля. Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами. Пример 1. Обследованы 15 здоровых доноров, результаты сопоставлены с данными обследования 15 больных с различными хирургическими заболеваниями, связанными с наличием синдрома эндогенной интоксикации организма (аппендицит, острый панкреатит, гнойная инфекция мягких тканей). Определение степени эндогенной интоксикации определяли по заявляемому способу № 1 следующим образом. Пробирки, содержащие 1,0 мл сыворотки крови 15 больных и 15 здоровых доноров, помещали на водяную баню и выдерживали 3 минуты при температуре 100°С. Затем в пробирки добавляли 4 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивали и центрифугировали образцы в течение 5 минут при 6000 об/мин. В чистые пробирки, содержащие 7 мл дистиллированной воды, добавляли по 0,5 мл полученного супернатанта и тщательно перемешивали. Растворы супернатанта наливали в кварцевые кюветы и измеряли спектры поглощения в диапазоне от 200 до 330 нм против дистиллированной воды, с шагом измерения 4 нм. Для каждого образца вычисляли интегральное поглощение в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм и оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле
Сопоставительный анализ критериев Стьюдента в таблице 1 свидетельствуют о том, что отношение разности между средними значениями оценочных показателей эндогенной интоксикации Аналогичное сопоставление для тех же образцов крови по показателям эндогенной интоксикации, определяемых известным способом на длине волны 254 и 280 нм, показало, что отношение разности средних значений оптических плотностей для групп больных и доноров, определяемых на длине волны 254 и 280 нм по известному способу, к стандартной ошибке разности этих показателей составило 1,2 и 1,4 соответственно. Полученные результаты свидетельствует о том, что достоверность различия между оптическими плотностями для группы больных и здоровых доноров, определяемых известным способом, не превышает 76 и 83% с уровнем значимости р 0,24 и 0,17 соответственно. Таким образом, сопоставление критериев Стьюдента для двух способов показало, что определение эндогенной интоксикации по заявляемому способу превосходит известный способ по достоверности различий между группами здоровых и больных. Вероятность ошибки в определении эндогенной интоксикации у больного по заявляемому способу составляет 0,01%. Известный способ не обеспечивает такой достоверности. Пример 2. Больной Б-ев Н.А., 50 лет. Поступил в хирургическое отделение ГКБ № 13 с жалобами на боли в правом подреберье, рвоту, повышенную температуру до 38°С. При осмотре: больной бледный, вялый, пониженного питания. Язык сухой, обложен белым налетом. Частота сердечных сокращений 120 ударов в минуту, частота дыхания 22 в минуту. Живот симметричный, в дыхании не участвует, при пальпации резко болезненный в правом подреберье, напряжен, симптомы раздражения брюшины резко положительные, перистальтика кишечника резко ослаблена. После дополнительных инструментальных исследований был поставлен диагноз: Острый калькулезный обтурационный холецистит. Перивезикальный абсцесс. Эндогенную интоксикацию определяли по уровню веществ низкой и средней массы способом №2 следующим образом. Из кубитальной вены брали 5 мл крови, для отделения сыворотки от форменных элементов центрифугировали при 6000 оборотах 5 минут. Затем 1 мл сыворотки помещали в пробирку и нагревали на водяной бане до 100° в течение 3 минут. После этого в пробирку с денатурированным белком добавляли 4 мл дистиллированной воды и стеклянной палочкой тщательно перемешивали, далее пробирку для осаждения осадка центрифугировали при 6000 оборотах 5 минут. После этого отбирали 0,5 мл осветленного надосадка и прибавляли 7 мл дистиллированной воды. Затем на спектрофотометре определяли оптическую плотность раствора в диапазоне 200-230 нм, с шагом измерения 2 нм. Для определения уровня эндогенной интоксикации вычисляли оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле
Таким образом, уровень эндогенной интоксикации у данного больного составил 89%, что свидетельствовало о средней тяжести эндогенной интоксикации. Стандартные данные клинико-лабораторного обследования подтверждали наличие выраженной эндогенной интоксикации. Анализ крови: эритроциты 4,7×1012, гемоглобин 98 г/л, лейкоциты 21,1×109, эозинофилы – 1, палочкоядерные нейтрофилы – 41, сегментоядерные нейтрофилы – 40, лимфоциты – 10, моноциты – 8; СОЭ – 28 мм/ч. Пример 3. Больная О-ва М.М., 67 лет, находилась на лечении в отделении интенсивной терапии ГКБ №13 по поводу: Смешанного панкреонекроза с поражением забрюшинной клетчатки с двух сторон. Диффузного ферментативного перитонита. Больной при поступлении проведено наряду с общим обследованием определение эндогенной интоксикации по заявленному способу так, как описано в примере 2. Уровень эндогенной интоксикации, который определяли, по заявленному способу составил 241%. Учитывая степень эндогенной интоксикации больной, решено к проводимой комплексной терапии добавить экстракорпоральную детоксикацию. На вторые сутки больной провели сеанс плазмосорбции. Исходный уровень эндогенной интоксикации, определенный по заявленному способу, с 241% снизился до 133%. Как видно из примера, предлагаемый способ позволяет не только оценивать тяжесть эндогенной интоксикации, но и контролировать эффективность экстракорпоральных методов детоксикации. Пример 4. Обследованы 30 здоровых доноров, результаты сопоставлены с данными обследования 30 больных с некротическим панкреатитом. Определение степени эндогенной интоксикации определяли по заявленному способу так, как описано в примере 2. Для каждого образца вычисляли оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле:
Полученные результаты в таблице 2 свидетельствуют о том, что разность между минимальным значением оценочного показателя эндогенной интоксикации Сопоставление минимального значения Заявляемый способ имеет большое социально-экономическое значение, поскольку существенно улучшает диагностику эндогенной интоксикации при острых хирургических заболеваниях и повышает достоверность полученных результатов, что очень важно в лечении этой категории больных.
Формула изобретения
1. Способ определения наличия эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы, отличающийся тем, что сыворотку крови освобождают от высокомолекулярных белков кипячением с последующим центрифугированием, затем выполняют спектрофотометрирование водного раствора супернатанта в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм, после чего производят расчет оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле:
где Dx(
и при значении 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кипячение сыворотки крови проводят в течение 3 мин при температуре 100°С и центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин, затем супернатант разводят дистиллированной водой.
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 29.09.2007
Извещение опубликовано: 10.04.2009 БИ: 10/2009
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
) и при значении 
единиц оптической плотности, а для больных Dбольн.(254 нм)
0,136 единиц оптической плотности (патент RU №2193780, МКИ G01N 33/68, 33/48 от 27.11.2002).
) – спектр оптической плотности раствора супернатанта, полученного из образца сыворотки крови;
– средний спектр оптической плотности, полученный путем усреднения индивидуальных спектров поглощения растворов супернатанта из сыворотки крови здоровых доноров;
j(
– интегральный коэффициент экстинкции j-го хромофора в исследуемом образце;
– интегральный коэффициент экстинкции j-го хромофора в составе веществ низкой и средней молекулярной массы у здоровых доноров;
– концентрация веществ низкой и средней молекулярной массы в исследуемом образце;
– средняя концентрация веществ низкой и средней молекулярной массы в супернатанте из крови здоровых доноров.
и 
где 
где 
где 
0,0001
– средний спектр оптической плотности, полученный путем усреднения индивидуальных спектров поглощения растворов супернатанта из сыворотки крови здоровых доноров;