Патент на изобретение №2324940
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ КЛИНИЧЕСКОЙ ФОРМЫ ЦИСТНОГО ЭХИНОКОККОЗА У ДЕТЕЙ
(57) Реферат:
Настоящее изобретение относится к диагностическим методам в медицинской паразитологии. Предложенный способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей заключается в том, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1, кодирующего фермент цитохром Р450. При обнаружении в генотипе аллеля Val прогнозируют риск развития цистного эхинококкоза у обследуемого. Использование изобретения дает возможность прогнозировать цистный эхинококкоз с высокой точностью.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”Med Int Health. 2001 Jun; 6(6):463-75, найдено в PubMed, PMID: 11422961. POLAT P et al. Hydatid disease from head to toe. Radiographics. 2003 Mar-Apr; 23(2):475-94; quiz 536-7, найдено в PubMed, PMID: 12640161. FILICE С, BRUNETTI E, Use of PAIR in human cystic echinococcosis. Acta Trop. 1997 Apr 1; 64(1-2):95-107, найдено в PubMed, PMID: 9095291.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицинской паразитологии, и может быть использовано для выявления групп риска к заболеванию цистным эхинококкозом детей. Исследования показали, что интенсивность инвазии в очаге определяется в большой степени особенностями индивидуальной восприимчивости к заболеванию. В этой связи особую актуальность представляет определение прогностических критериев среди генетических маркеров риска. Таким образом, разработанные в настоящее время клинические, иммунологические, инструментальные методы не позволяют достоверно прогнозировать развитие эхинококковых кист, поскольку имеют следующие недостатки: – отсутствие диагностических маркеров болезни на ранних этапах развития патологии из-за разнообразия клинических проявлений; – недостаточно эффективные инструментальные методы при выявлении мелких кист; – недостаточно чувствительные серологические реакции; Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования кист у инвазированных эхинококком детей. Нами выявлено, что среди детей, больных эхинококкозом, значительна доля лиц носителей полиморфной аллели Val гена CYP1A1 ( Таким образом, генетическое тестирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1 детей инвазированных эхинококком, позволяет с большой вероятностью (OR=6,81) прогнозировать возможность клинической манифестации до появления первых симптомов болезни. Метод доступен по реактивам и оборудованию. Техническим результатом изобретения является получение критериев прогнозирования развития клинической формы эхинококкоза у детей на основе выявления молекулярно-генетических маркеров. Способ осуществляется следующим образом. 1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисHCl (pH 7,6). 2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин. 3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют. 4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация – 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С. Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке. 1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0.5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до pH 7,8. 2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. 3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и не денатурированные белки. 4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем – хлороформом. 5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола. 6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н2O; раствор хранят при 20°C. В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента. F. 5’GAACTGCCACTTGAGCTGTCT3′ и R. 5’GAAAGACCTCCCAGCGGTCA3′. Схема ПЦР следующая. Реакционная смесь содержит 2,5 мкл 10×ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl pH 8.5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 0.1% тритон Х-100), 1 мкл смеси 5 мМ каждого dNTP, по 1 мкл соответствующих праймеров, примерно 200 нг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы с добавлением деионизированной воды до объема 25 мкл. OR=(a×d)/(b×c) где a – число лиц с наличием, b – с отсутствием маркера (аллеля Val гена CYP1A1) среди больных эхинококкозом; c и d – число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых индивидов. Повышенный риск развития констатировали при OR>1, RR>2. Нами были исследованы дети (N=72), больные цистным эхинококкозом. Возраст пациентов – от 4 до 16 лет. Основную долю обследованных лиц составили дети школьного (69%) возраста. По половому составу распределение было следующим: 57% мальчики, 43% девочки. Поражение печени наблюдалось у 48% пациентов, легкого – 28%, сочетанное поражение легкого и печени – 23%. Установлено, что распределение частот генотипов гена CYP1A1 у больных эхинококкозом существенно отличалось от контроля. При изучении полиморфизма A-G гена CYP1A1 у больных ЦЭ выявлено, что частота встречаемости гомозигот Ile/Ile составляет 73,5% (в контроле 95,2%), гетерозигот Ile/Val составляет – 22,3% (в контроле 4,0%), гомозигот Val/Val – 4,2% (в контроле 0,5%). Частота носителей аллеля Val составляет 26,5%, в 4 раза больше чем в контроле ( Полученные результаты показывают, что наличие полиморфного аллеля Val гена CYP1A1 в генотипе является предрасполагающим фактором к развитию клинической формы цистного эхинококкоза у детей, поэтому его можно использовать в качестве генетического маркера риска. Пример 1. У девочки З., 5 лет при массовом обследовании методом ИФА (иммуноферментный анализ) выявлена положительная реакция. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем аллеля Val гена CYP1A1. В отношении развития эхинококковых кист прогноз неблагоприятный. После обследования (УЗИ, КТ) выявлена эхинококковая киста печени, малых размеров. Пример 2. У девочки М., 7 лет, брат поступил в хирургическое отделение с диагнозом: эхинококковая киста правого легкого. Девочке проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем генотипа Ile/Ile гена CYP1A1. В отношении развития эхинококковых кист прогноз благоприятный. Через год проведено исследование УЗИ. Признаков развивающейся кисты эхинококка у пациентки не обнаружено.
Формула изобретения
Способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей, характеризующейся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1, кодирующего фермент цитохром Р450, и при обнаружении в генотипе аллеля Val прогнозируют риск развития цистного эхинококкоза у обследуемого.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 01.03.2009
Извещение опубликовано: 20.10.2010 БИ: 29/2010
|
||||||||||||||||||||||||||
2=14,21; р=0,001, OR=6,81).