Патент на изобретение №2324734

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS ВКМ В-2396 D – ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства ферментных препаратов термостабильной -амилазы. Изобретение позволяет повысить выход термостабильной -амилазы. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства ферментных препаратов термостабильной -амилазы, применяемой в различных областях промышленности.

Амилолитические ферменты широко используются для разжижения или превращения крахмала и крахмалосодержащего растительного сырья в такие продукты, как мальтодекстрины, сахарные сиропы, декстроза, мальтоза, глюкоза и др.

В большинстве промышленных процессов необходимо применение термостабильных амилолитических ферментов, что обусловлено их способностью вести гидролиз сырья при высоких температурах – 80-100°С. Преимуществом высокотемпературного процесса является совмещение процесса клейстеризации крахмала и его ферментативного гидролиза, снижение дозировки ферментов, сокращение продолжительности конверсии крахмала, увеличение выхода конечного продукта, уменьшение себестоимости процесса.

В мировой практике в качестве продуцентов коммерческих препаратов -амилаз наиболее широко используют бактерии рода Bacillus: B.subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens, B.stearothermophilus и др. (1-9).

У природных штаммов способность к биосинтезу термостабильных амилолитических ферментов обнаруживается редко (2-3, 7, 9). Как правило, уровень амилолитической активности данных продуцентов существенно уступает продуктивности мезофильных штаммов. Известны рекомбинантные штаммы-продуценты термостабильной -амилазы, проводились исследования по повышению термостабильности мезофильных -амилаз за счет введения дисульфидных связей в аминокислотную последовательность молекулы фермента (10-14). Однако использование рекомбинантных штаммов существенно усложняет процесс получения на их основе промышленных ферментных препаратов и, соответственно, повышает стоимость технологии и себестоимость конечного продукта.

В России в настоящее время в промышленном масштабе выпускается препарат бактериальной -амилазы на основе B.subtilis – Амилосубтилин. Однако данная -амилаза не относится к разряду термостабильных, оптимальная температура ее действия составляет 65-70°С.

Известен (SU, авторское свидетельство 1788966 С 12 N 1/21, 1993) штамм бактерий Bacillus amylollquefaciens – продуцент -амилазы Bacillus licheniformic, имеющий регистрационный номер ВКПМ В-5208 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и секретирующий 220-250 ед. активности фермента на 1 мл культуральной жидкости. Активность -амилазы была определена в соответствии с методикой Госстандарта ГОСТ 20264.4-74.

Известен (SU, авторское свидетельство 1344247, С12N 9/32, 1987) штамм Bacillus licheniformis ATCC 39326 – продуцент термостабильной -амилазы. При культивировании указанного штамма на среде, содержащей лактозу, источник азота, минеральные компоненты и воду при рН 5,5-8,0, получают термостабильную -амилазу с активностью 1500-2000 ликфон-мл после 72 часов культивирования.

Известен (RU, патент №2001103, С12N 9/26, 1993) аэробный термофил B.licheniformis, который при культивировании на среде с кукурузной мукой оптимального для получения продукта состава синтезирует комплекс внеклеточных амилолитических ферментов: -амилазу, -глюкозидазу и пуллуланазу. Известный штамм выделен из естественной почвенной ассоциации, продуцируют в заданных условиях не менее трех термостабильных амилолитических ферментов, активных в диапазоне рН 5,0-10,0, активен при 30-100°С с максимальной активностью ферментов в культуральной жидкости при 90-95°С. Штамм термостабилен в водных растворах рН 6,0-8,5 в течение 40 минут. Активность -амилазы – 1,78 ед/мл/мин, -глюкозидазы – 3,49 ед/мл/мин и пуллуланазы – 0,68 ед/мл/мин.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм B.licheniformis-78 (депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2184 Д). Выращивание штамма проводят при 40°С в течение 80-100 ч на мучной среде состава, г/л: кукурузная мука – 160,0; кормовые дрожжи – 30,0; NaH₂PO₄ – 3,0; MgSO₄ – 2,0; СаСО₃ – 2,5; рН 7,2-7,4. В данных условиях штамм продуцирует комплекс термостабильных ферментов, в том числе -амилазу и пуллуланазу, и обладает сопутствующими протеолитической и целлюлолитической активностями, обеспечивающими более глубокий и эффективный гидролиз комплексного сырья. Максимальная активность -амилазы составляет 200-230 ед/мл.

-Амилаза, синтезируемая продуцентом, характеризуется широким рН-диапазоном активности рН 5,0-10,0 и способностью гидролизовать субстрат при высоких температурах 90-105°С.

Недостатком штамма является сравнительно низкий уровень амилолитической активности, что препятствует созданию рентабельной технологии производства ферментного препарата термостабильной -амилазы.

Техническая задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в получении нового высокоактивного продуцента, обеспечивающего высокий уровень активности термостабильной -амилазы.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в обеспечении высокого уровня активности термостабильной -амилазы в ферментационной среде.

Сущность объекта изобретения – новый специально селекционированный штамм бактерий Bacillus licheniformis 103 – продуцент комплекса термостабильных амилолитических ферментов.

Штамм бактерий В.licheniformis 103 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ-B-2396-D.

Штамм бактерий В.licheniformis 103 выделен селекционным путем при изучении естественной изменчивости штамма В.licheniformis BKM В-2184 Д с применением методов эффективного мутагенеза ультрафиолетовым облучением и обработкой нитрозогуанидином.

Условия хранения. Штамм может храниться без потери полезных свойств при комнатной температуре на косяках с агаризованной средой следующего состава: мясопептонный бульон и солодовое сусло (7°Б) в соотношении 1:1; растворимый крахмал 1,0%; агар-агар 2,0%; рН среды 7,5, не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже одного раза в 2 месяца.

Основной метод длительного хранения штамма – метод лиофилизации.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Клетки представляют собой грамположительные, одиночные, подвижные палочки размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мкм, спорообразующие. В первые часы роста (логарифмическая фаза) образуются цепочки из 2-4 клеток более вытянутой формы, к 48-56 ч роста (стационарная фаза) цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

На мясопептонном агаре (40°С, 24 ч) штамм дает обильный рост, колонии неправильной формы, плоские, слизистые, гладкие, непрозрачные, 3-6 мм в диаметре с ровными краями, в начале роста – кремовые, затем постепенно розовеющие.

При выращивании на мясопептонном бульоне (40°С, 24 ч) – обильный рост клеток, раствор становится мутным, к 24 ч роста появляется кремово-розовый оттенок.

На агаризованной среде с крахмалом отмечается обильный рост и образование зон гидролиза вокруг колоний. Колонии неправильной формы, слизистые, гладкие, непрозрачные, 2-4 мм в диаметре, с ровными краями. К 72 ч появляется коричнево-розовый цвет.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб. Температурный диапазон роста – 18-45°С. Оптимальная температура роста 40°С. Растет при значениях рН среды – 5,0-10,0. Оптимум рН роста – 6,5-8,0.

Крахмал быстро гидролизует, желатин разжижает. Восстанавливает лакмусовое молоко. Нитраты восстанавливает до нитритов. Синтезирует тирозиназу, образует сероводород. Сбраживает с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, раффинозу, маннозу, маннит, сорбит, глицерин, декстрин, гликоген без выделения газа, глюкозу ферментирует анаэробно, утилизирует лимонную кислоту.

Штамм способен расти на средах с аммонийными солями в качестве единственного источника азота.

На основании указанных свойств штамм BKM-B-2396-D идентифицирован по Определителю Берги (15) как штамм Bacillus licheniformis.

Вид В.licheniformis, к которому отнесен штамм В.licheniformis BKM-B-2396-D, не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения», отсутствует в списках патогенных бактерий по Положению Минздрава и в списках патогенных бактерий в Official Journal of the European Communities NC 217/3237, 24.08.92.

Полученный мутант В.licheniformis 103 BKM-B-2396-D отличается от наиболее близкого к нему штамма В.licheniformis BKM В-2184 Д более плоской формой колоний, более плотной слизистой консистенцией. Штамм BKM-B-2396-D, как и BKM В-2184 Д, сохраняет устойчивость к антибиотику стрептомицину, свидетельствующую о мутации 30S субчастицы рибосомы, и способность к биосинтезу сопутствующих ферментов: пуллуланазы, протеазы, -глюканазы, -ламинариназы.

Для роста культуры и биосинтеза термостабильной -амилазы источником углерода могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, мальтоза, кукурузная и другая зерновая мука. Источником азота служат соевая мука, дрожжевые клетки.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 40°С в течение 80-120 ч, рН среды 7,0-8,5. Каждые 24 ч, начиная с 48 ч роста, отбирают пробы, в которых определяют амилолитическую активность и при необходимости активности сопутствующих ферментов.

Активность -амилазы в культуральной жидкости определяют по способности катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы (16). За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 10 минут при 90°С при рН 7,5 катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

При необходимости определяют активности сопутствующих ферментов согласно следующим методикам.

Активность пуллуланазы определяют по восстанавливающим сахарам, образующимся при гидролизе пуллулана (линейного полисахарида, состоящего из мальтотриозных единиц, соединенных -1,6-гликозидными связями). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое при 60°С, рН 6,0 гидролизует пуллулан со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы в минуту, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (17).

Протеолитическую активность определяют по методу Каверзневой, используя в качестве субстрата 2%-ный раствор казеина (18). За единицу протеолитической активности (ПЕ) принято такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30°С катализирует переход в неосаждаемое ТХУ состояние такого количества казеина, которое содержит 1 мкмоль тирозина.

-Глюканазную активность определяют по способности образовывать восстанавливающие сахара из ячменного -глюкана с последующим определением образовавшихся сахаров по методу Сомоджи-Нельсона (17). За единицу активности принимают количество фермента, способного в минуту в стандартных условиях при температуре 50°С и рН 5,5 из -глюкана образовать такое количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соответствует 1 мкмолю глюкозы. Активность -ламинариназы определяют аналогичным способом, но в качестве субстрата используют ламинарин.

Наличие сопутствующей пуллуланазной активности позволяет гидролизовать не только -1,4-, но и -1,6-гликозидные связи в молекуле крахмала до декстринов с образованием глюкозы и низкомолекулярных мальтоолигосахаридов.

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых осаждением этанолом или другими органическими растворителями из ультрафильтрата культуральной жидкости, а также высушиванием или гранулированием.

-Амилаза активна в диапазоне значений рН 5,0-10,0 с двумя заметными пиками активности при рН 7,5 и 8,5; при температуре 30-105°С с оптимумом активности при 90-95°С. Фермент способен сохранять активность без изменений в водных растворах при температуре 90°С и рН 6,0-8,5 в течение 40 минут, в присутствии ионов кальция (0.005М) – 2 часа; при температуре 100°С в присутствии ионов кальция активность не меняется в течение 20 минут.

Таким образом, свойства фермента -амилазы и наличие сопутствующих активностей обеспечивают эффективность использования ферментного препарата при биоконверсии растительного сырья.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал (инокулюм) получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава: крахмал растворимый – 1%; мясопептонный бульон и солодовое сусло в соотношении 1:1, рН среды 7,5. Культивирование проводят в колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 38-40°С в течение 48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 50 мл среды состава, г/л: кукурузная мука – 150,0; соевая мука – 30,0; СаСО₃ – 2,5; MgSO₄×7H₂O – 2,0, рН среды 7,0-7,5.

Среду предварительно обрабатывают ферментным препаратом бактериальной -амилазы из расчета 2 ед/г крахмала при 70°С в течение 20 минут.

Культивирование осуществляют в аэробных условиях на качалке (240 об/мин) при температуре 40-42°С.

Максимальная ферментативная активность термостабильной -амилазы на 120 ч роста составляет 187 ед/мл.

Активности сопутствующих ферментов составляют: пуллуланаза – 50 ед/л, протеаза – 40 ед/мл, -глюканаза – 42 ед/мл, -ламинариназа – 18 ед/мл (Таблица 1).

Таблица 1. Динамика накопления активности ферментов в процессе культивирования штамма Bacillus licheniformis BKM-B-2396-D.
Возраст культуры, ч	Активность культуральной жидкости
	-амилаза, ед/мл	пуллуланаза, ед/л	протеаза, ед/мл	-глюканаза, ед/мл	-ламинариназа, ед/мл
48	42	2	26	3	0
72	87	18	80	11	5
96	134	32	73	38	12
120	187	50	40	42	18

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, г/л: кукурузная мука – 80,0; пшеничная мука – 80,0; соевая мука – 30,0; СаСО₃ – 2,5; MgSO₄×7H₂O – 2,0, рН среды 7,0-7,5.

Максимальные ферментативная активность термостабильной -амилазы на 120 ч роста составляет 245 ед/мл.

Пример 3. Культивирование осуществляют в качалочных колбах как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, г/л: экструдат кукурузной муки – 80,0; экструдат пшеничной муки – 80,0; соевая мука – 30,0; СаСО₃ – 2,5; MgSO₄×7H₂O – 2,0, рН среды 7,0-7,5.

Максимальные ферментативная активность термостабильной -амилазы на 120 ч роста составляет 250 ед/мл.

Пример 4. Проводят процесс культивирования в лабораторных ферментерах фирмы “Anglican” (Великобритания), емкостью 3 л, оснащенных системами автоматического регулирования рН, pO₂, температуры и пеногашения. Массообмен осуществляется при помощи барботера и 3-х ярусной мешалки, обеспечивающих аэрацию – до 15 г O₂/л·ч.

Условия культивирования: коэффициент загрузки ферментеров -0,5; посевной материал – вегетативная культура, выращенная в колбах (по примеру 1); доза засева посевной культуры в ферментер – 2%. Температурный режим – дифференцированный: первые 48 ч культивирования 41°С, далее 38°С.

Состав ферментационной среды, г/л: экструдат кукурузной муки – 150,0; соевая мука – 20,0; СаСО₃ – 2,5; MgSO₄×7H₂O – 2,0, рН среды 7,0-7,5.

На 24 и 30 ч культивирования вносят подпитку в виде 50%-го гидролизата экструдата кукурузной муки в количестве 5% от объема ферментационной среды.

Активность термостабильной -амилазы на 120 ч культивирования составляет 260 ед/мл.

Таким образом, заявляемый штамм Bacillus licheniformis ВКМ-В-2396-D обладает повышенной способностью синтеза термостабильной -амилазы.

Для достижения высокой активности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Высокий уровень активности термостабильной -амилазы и наличие сопутствующих ферментов позволяют рассматривать штамм как продуцент ферментативного комплекса, перспективного для обработки крахмала или крахмалосодержащего сырья с целью его глубокого гидролиза.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus licheniformis BKM B-2396 D – продуцент термостабильной -амилазы.