Патент на изобретение №2324703
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПЕПТИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ФУНКЦИЮ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относится к применению дипептида общей формулы N
Изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим пептиды, и касается дипептида, а также композиции на его основе и может быть использовано в медицинской практике в качестве средства, стимулирующего функцию половой системы, при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез при старении организма. В данном случае под стимуляцией понимается усиление мотивационной составляющей полового поведения самцов животных, проявляющееся в сокращении временных интервалов, а также активация спаривательного поведения, проявляющаяся в увеличении количества копуляторных элементов – садок, интромиссий и эякуляций. Однако эти препараты имеют серьезные недостатки: так, апоморфин может вызывать рвоту, а йохимбин – двигательные расстройства. Известны пептидные соединения, применяемые в качестве средств, стимулирующих функцию половой системы, среди которых следует отметить нейропептиды, обладающие центральным действием и оказывающие стимулирующее влияние на половое поведение. При этом необходимо отметить, что пептиды ACTH/MSH и окситоцин имеют целый ряд побочных эффектов и поэтому их использование в медицинской практике, в том числе для стимуляции полового поведения ограничено. Известно использование пептидов для лечения эректильной дисфункции (РСТ WO 94/22460, патентах США №№5955421; 5932548 и патенте РФ №2264823). Однако применение этих пептидов ограничивается только эректильной дисфункций и не распространяется на другие компоненты полового поведения самцов животных, которые являются наиболее важными при возрастном снижении половой активности. С другой стороны, с точки зрения физиологии эрекция без сексуальной стимуляции не является оптимальной. Исходя из этого разработка эффективного биологически активного соединения пептидной природы, стимулирующего функцию половой системы, является актуальной. Из уровня техники (Squires E.J., Feltham L.A., “Isolation, characterization and seasonal variations in the concentration of N-epsilon-(gamma-glutamyl)-lysine isodipeptide in the blood plazma of the winter flounder (Pseudopleuronectes americanus)”, Biochem J. 1980 Mar 1; 185(3): 761-6 известно получение вариантов дипептидов Glu-Lys, в том числе N Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения нового биологически активного соединения пептидной природы, стимулирующего функцию половой системы мужчин. Технический результат изобретения заключается в создании дипептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в стимулировании функции половой системы, а также фармацевтической композиции, содержащей этот дипептид в качестве активного начала, использование которого стимулирует функцию половой системы, путем модуляции нейроэндокринного статуса при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез в процессе старения организма. Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные по методикам, принятым в данной области. Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом. Настоящее изобретение относится к применению дипептида, представляющего собой N Другим объектом предложенной группы изобретений является фармацевтическая композиция, стимулирующая функцию половой системы, содержащая в качестве активного начала эффективное количество дипептида N Следующий аспект настоящего изобретения касается способа стимуляции функции половой системы, заключающегося во введении фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала дипептид N При этом введение осуществляют парентерально. Дипептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе (Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. – М.: Мир, 1985. – 456 с.). Действие дипептида N Модулирующее влияние дипептида N Изучение влияния дипептида N В результате экспериментального изучения установлено, что дипептид N Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие дипептид, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего функцию мужской половой системы. Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество дипептида N Понятие “эффективное количество” подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме. Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм. Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности. Предлагаемый дипептид может быть введен парентерально в соответствующим образом приготовленной лекарственной форме с фармацевтически приемлемыми наполнителями. Сущность изобретения поясняется девятью таблицами. В Таблице 1 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение старых самцов крыс при однократном введении в дозировке 100 мкг на животное. В Таблице 2 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение старых самцов крыс при 18-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное. В Таблице 3 представлены данные по влиянию дипептида на нейромедиаторный статус гипоталамуса, гиппокампа и амигдалы старых самцов крыс при 18-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное. В Таблице 4 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при однократном введении в дозировке 100 мкг на животное. В Таблице 5 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при однократном введении в дозировке 250 мкг на животное. В Таблице 6 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при 6-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное. В Таблице 7 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при 12-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное. В Таблице 8 представлены данные по влиянию однократного введения дипептида в дозировке 250 мкг на животное на эндокринный статус самцов крыс после односторонней гонадэктомии. В Таблице 9 представлены данные по влиянию 18-кратного введения дипептида в дозировке 50 мкг на животное на эндокринный статус самцов крыс после односторонней гонадэктомии. Настоящее изобретение иллюстрируется примером синтеза дипептида N Приведенные в примерах, иллюстрирующих изобретение, результаты доклинического изучения дипептида N Пример 1. Синтез дипептида N 1. Название соединения: N 2. Структурная формула: (H-Glu-OH)-Lys-OH
3. Брутто-формула без противоиона: C11H21N3O5 4. Молекулярный вес без противоиона: 275,30 5. Противоион: ацетат 6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха 7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме
ВОС – трет.бутилоксикарбонильная группа, OSu – N-оксисукцинимидный эфир, DCC – N,N’-дициклогексилкарбодиимид, OBut – трет.бутиловый эфир, TFA – трифторуксусная кислота 6. Характеристики готового препарата: – содержание основного вещества: 98,40% (по ВЭЖХ, 220 нм) – ТСХ – индивидуален, Rf=0,80 (ацетонитрил-вода 1:3) – содержание влаги: 7% – рН 0,001% раствора: 4,50 – Удельное оптическое вращение: [ 1) BOC-Glu(OSu)-OBut (I),
2) (BOC-Glu-OBut)-Lys(BOC)-OH (II), N N 3) (H-Glu-OH)-Lys-OH, N 1,0 г Защищенного дипептида (BOC-Glu-OBut)- Lys(BOC)-OH (II) растворяли в 10 мл хлороформа, добавляли 2,0 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Далее растворитель упаривали в вакууме. Для очистки препарат растворяли в 5 мл 0,01% трифторуксусной кислоты (рН пробы 2,5) и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50×250 мм Diasorb-130-C16T, 7 Условия хроматографирования – A: 0,1% TFA; В: 50% MeCN in 0.1% TFA; градиент В: 0 Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (не менее 5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 50 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 300 мг очищенного препарата в виде аморфного порошка белого цвета без запаха. 4) Анализ готового препарата. – Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex С-18 LUNA 4,6х150 mm. A: 0,1% TFA, B: MeCN; градиент В 0-100% in 10 min. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при длине волны 220 нм, сканирование при длине волны 190-600 нм, проба 20 – ТСХ: индивидуален, Rf=0,80 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1 ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин). – содержание влаги: 7% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при температуре 100°С). – рН 0,001% раствора: 4,50 (потенциометрически). – Удельное оптическое вращение: [ Пример 2. Изучение влияния дипептида N Исследование влияния дипептида N В эксперименте использовали 16 крыс-самцов в возрасте 18 месяцев с массой тела 400-500 г и 8 крыс-самцов в возрасте 4 месяцев с массой тела 250-300 г. Животных разделили на 3 группы: 8 старых самцов образовали подопытную группу, а группы из 8 старых и 8 молодых животных использовали в качестве положительного и отрицательного контролей. Животным подопытной группы за 1 ч до исследования внутрибрюшинно вводили дипептид N После введения дипептида N Таким образом, применение дипептида при однократном введении позволило активизировать половую функцию старых самцов крыс как со стороны мотивационной составляющей, так и со стороны периферической составляющей. При этом параметры полового поведения старых животных приближались к таковым, характерным для молодых животных, кроме этого отмечалось существенное увеличение физической выносливости. Пример 3. Изучение влияния дипептида N В эксперименте использовали 16 крыс-самцов в возрасте 18 месяцев с массой тела 400-500 г и 8 крыс-самцов в возрасте 4 месяцев с массой тела 250-300 г в качестве контрольной группы. Эксперимент проводили по методике, описанной в примере 2, при этом подопытная группа животных ежедневно получала дипептид N После 6-кратного введения дипептида также наблюдали активацию полового поведения у старых животных (Таблица 2). Латентные периоды садки и интромиссии достоверно сокращались по сравнению с контрольной группой старых животных на 37,5% (р<0,05) и 60,7% (р<0,05) соответственно, а период восстановления достоверно уменьшался на 31,6% (р<0,05). Число садок и интромиссии при этом достоверно увеличивалось на 30,8% (р<0,05) и 40,6% (р<0,05) соответственно; кроме того, достоверно возрастало количество эякуляций на 38,9% (р<0,05). Приведенные данные позволяют говорить об активирующем влиянии многократного введения дипептида N Следовательно, хроническое введение дипептида привело к более выраженному эффекту активации полового поведения старых самцов крыс. Значительное сокращение временных латентных интервалов позволяет предположить стимулирующее влияние дипептида на центральную, мотивационную, составляющую полового поведения, а увеличение количества копуляторных элементов, особенно эякуляций, подразумевает положительное воздействие дипептида на периферические механизмы регуляции полового поведения. Концентрацию норадреналина (НА), дофамина (ДА) и серотонина (СТ) в гипоталамусе, гиппокампе и амигдале животных обеих групп определяли методом HPLC на хроматографе «Beckman System Gold» с электрохимическим детектором LC-4C. Образцы мозговой ткани выделяли при температуре минус 20°С и хранили в жидком азоте до хроматографического анализа. Идентификацию и количественную оценку содержания нейромедиаторов производили по отношению площади полученных пиков к площади пиков от внешних стандартов. Результаты исследования показали, что 18-кратное введение дипептида N Таким образом, 18-кратное введение дипептида старым самцам крыс препятствует возрастным изменениям медиаторного статуса гипоталамуса, гиппокампа и амигдалы, что позволяет предположить модулирующее влияние дипептида на дофаминергическую и норадренергическую системы указанных мозговых структур. Пример 4. Изучение влияния дипептида N В эксперименте были использованы 24 крысы-самца с односторонней гонадэктомией (ГГЭ) в возрасте 5 месяцев с массой тела 300-400 г и 8 интактных крыс-самцов того же возраста с массой тела 250-350 г, составивших группу положительного контроля. Из 24 оперированных животных были сформированы 2 подопытные группы по 8 животных в каждой, получавшие внутрибрюшинно дипептид N После введения гемигонадэктомированным самцам 100 мкг дипептида N При увеличении количества вводимого дипептида N Таким образом, введение дипептида гемигонадэктомированным самцам крыс позволило нивелировать последствия односторонней гонадэктомии, причем действие препарата носило дозозависимый характер: так, увеличение дозировки до 250 мкг на животное приводило к почти полной нормализации полового поведения. Пример 5. Изучение влияния дипептида N В эксперименте были использованы 16 крыс-самцов с односторонней гонадэктомией (ГГЭ) в возрасте 5 месяцев с массой тела 250-350 г и 8 интактных крыс-самцов того же возраста, составивших группу положительного контроля. Из 8 оперированных животных была сформирована подопытная группа, ежедневно получавшая внутрибрюшинно дипептид N После 6-кратного введения дипептида N Увеличение кратности введения препарата до 12 приводило к дальнейшей активации мотивационной составляющей полового поведения самцов: ЛпС сокращался на 35,2% (р<0,05), а ЛпИ уменьшался на 51,9% (р<0,001) по сравнению со значениями, полученными у животных из группы отрицательного контроля. Количество садок не изменялось, однако число интромиссий увеличивалось на 42,2% (р<0,05). Число эякуляций недостоверно возрастало на 22,0% и достигало уровня, свойственного молодым интактным животным. Кроме того, наблюдалась тенденция к сокращению как латентного интервала эякуляции, так и межэякуляторного интервала (Таблица 7). Характер изменения этих параметров свидетельствует об активирующем влиянии дипептида N Последующее увеличение количества введений до 18 не приводило к дальнейшей активации полового поведения крыс-самцов с гипогонадным состоянием. Следовательно, многократное введение дипептида гемигонадэктомированным самцам крыс приводило к частичному восстановлению половой функции как со стороны мотивационной составляющей, так и со стороны периферических механизмов регуляции полового поведения. Однако при данном способе введения эффект был менее выражен, чем при однократном введении дипептида в большей дозировке. Пример 6. Изучение влияния дипептида N Уровень гормонов (лютеинизирующего – ЛГ, фолликулостимулирующего – ФСГ, тестостерона – Т, пролактина – ПРЛ и адренокортикотропного гормона – АКТГ) определяли в сыворотке крови с помощью тест-наборов для иммуноферментного анализа in vitro (DRG, Германия и Хема-Медика, Россия-Италия). Исследование проводили на образцах сыворотки крови животных, которым однократно внутрибрюшинно вводили дипептид N Таким образом, однократное введение дипептида оказало модулирующее влияние на эндокринный статус гемигонадэктомированых самцов крыс, выражавшееся в повышении содержания в сыворотке крови животных лютеинизирующего и адренокортикотропного гормонов. Пример 7. Изучение влияния дипептида N Исследование проводили на образцах сыворотки крови животных, которым проводили 18-кратное внутрибрюшинное введение дипептида N Следовательно, 18-кратное введение дипептида гемигонадэктомированным самцам крыс приводило к резкому увеличению содержания лютеинизирующего и адренокортикотропного гормонов, а также наблюдалось снижение повышенного в результате односторонней гонадэктомии уровня пролактина, что особенно важно для нормализации полового поведения животных. Выявленные в результате экспериментального исследования свойства дипептида позволяют считать показанным его профилактическое и/или лечебное применение в качестве средства для стимуляции функции мужской половой системы при старении и гипогонадном состоянии. Пример 8. Изучение общетоксического действия дипептида N Общетоксическое действие дипептида N Исследование по изучению острой токсичности проведено на 60 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-23 г.Животные были разделены на 6 равных групп. Дипептид вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг в 0,1 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl. Исследования по изучению хронической токсичности проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-250 г и на 100 морских свинках-самцах с массой тела 300-350 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили дипептид внутримышечно в течение 90 дней, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, в дозах 100 мкг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в 0,25 мл 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме 0,9% раствор NaCl. До введения дипептида, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почек, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга. При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение дипептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 10000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата. Изучение хронической токсичности дипептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 5000 раз. Не отмечено достоверного влияния препарата на СОЭ, резистентность эритроцитов и биохимические показатели в сыворотке крови. При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены. Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую дипептид в качестве активной субстанции, для проведения клинических испытаний в качестве средства, стимулирующего функцию половой системы при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез при старении организма. Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы
Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы
Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы
Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы
Формула изобретения
1. Применение дипептида, представляющего собой N 2. Фармацевтическая композиция, стимулирующая функцию половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса, содержащая в качестве активного начала эффективное количество дипептида общей формулы N 3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения. 4. Способ стимуляции функции половой системы, заключающийся во введении фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала дипептид общей формулы N 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что введение осуществляют парентерально.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-(
-L-глутамил)-L-лизин для стимулирования функции половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса при старении и при гипогонадном состоянии. Также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая N
-трет.бутилоксикарбониллизин
. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module.
5% за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при длине волны 219 нм, сканирование при длине волны 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 57-64 мин.