Патент на изобретение №2323974

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS MACERANS BKM B-2419D – ПРОДУЦЕНТ ПЕКТАТЛИАЗЫ, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ И КОМПЛЕКСА ЩЕЛОЧНЫХ КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО КСИЛАНАЗУ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗУ, ГАЛАКТОМАННАНАЗУ, АРАБИНАЗУ, КСИЛОГЛЮКАНАЗУ И АМИЛАЗУ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Bacillus macerans BKM В-2419 D – продуцент пектатлиазы, пектинлиазы и полигалактуроназы и комплекса щелочных карбогидраз, содержащего ксиланазу, -глюканазу, галактоманнаназу, арабиназу, ксилоглюканазу и амилазу, может быть использован в микробиологической, пищевой, текстильной, целлюлозно-бумажной отраслях промышленности, а также в производстве кормовых добавок. Изобретение позволяет увеличить выход щелочных пектиназ и щелочных карбогидраз.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой, текстильной, целлюлозно-бумажной отраслях промышленности, а также в производстве кормовых добавок.

Для получения указанных ферментов в промышленности используются бактериальные и грибные продуценты различной видовой принадлежности. Однако, несмотря на то что грибы рода Aspergillus, как правило, образуют комплексы ферментов с широким спектром карбогидраз, компонентный состав комплексов сильно зависит от видовой принадлежности и варьирует у различных штаммов одного рода. Кроме того, как правило, грибные культуры (продуценты) образуют кислые пектиназы и гемицеллюлазы, проявляющие максимальное действие в кислой среде, и практически неактивны в щелочной. Однако в ряде процессов (биоскоринг текстильных изделий, мацерирующего воздействия при обработке льна, обработка целлюлозы и др.) требуются щелочные пектиназы и гемицеллюлазы, проявляющие свое максимальное действие в нейтральной и слабощелочной средах.

Известен (SU, авторское свидетельство 1162224) штамм Bacillus macerans ЦМПМ В-2692 – продуцент пектолитических ферментов, который в условиях глубинного культивирования образует эндо-полигалактуроназу с активностью 6,7 ед./мл, экзо-полигалактуроназу с активностью 5,3 ед./мл и пектат-трансэлиминазу с активностью 9000 ед./мл. Культивирование продуцента осуществляют при температуре 32-35°С, рН 6,8-7,2 в течение 18-20 ч. Существенными недостатками указанного штамма являются недостаточно высокая активность пектат-трансэлиминазы и узкий комплекс синтезируемых ферментов.

Наиболее близким аналогом полученного штамма можно признать (RU, патент 2272838) штамм Bacillus macerans BS-04 – продуцент пектиназ, а именно пектат- и пектинлиаз, эндо- и экзо-полигалактуроназ, пектинэстеразы; а также протеазы, ксиланазы, амилазы, характеризующийся коротким циклом роста с повышенным накоплением биомассы.

Штамм Bacillus macerans BS-04 выделен в результате многократного рассева исходного штамма Bacillus macerans ЦМПМ В-2692 и выделения моноспоровых вариантов.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в получении нового высокоактивного штамма бактерий Bacillus macerans – продуцента мультиферментного комплекса, состоящего из щелочных пектиназ – пектатлиазы, пектинлиазы, полигалактуроназы (с преимущественным содержанием пектатлиазы) и щелочных карбогидраз – ксиланазы, -глюканазы, галактоманнаназы, арабиназы, ксилоглюканазы и амилазы.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в расширении спектра субстратов, содержащих пектин, гемицеллюлозы и крахмал и повышении эффективности обработки этих субстратов в нейтральной и щелочных средах при использовании ферментов предлагаемого штамма.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм бактерий Bacillus macerans UV-21 – продуцент мультиферментного комплекса, состоящего из щелочных пектиназ -пектатлиазы, пектинлиазы, полигалактуроназы (с преимущественным содержанием щелочной пектатлиазы) и щелочных карбогидраз -ксиланазы, -глюканазы, галактоманнаназы, арабиназы, ксилоглюканазы и амилазы.

Штамм бактерий B.macerans UV-21 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ B-2419D.

Штамм B.macerans UV-21 получают с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры B.maceras, выделенной из лесной почвы. Суспензию спор исходного штамма, полученную в дистиллированной воде с добавлением 0,1% Твина-80, облучают ультрафиолетом (облучение световым потоком мощностью 3 м Вт/см²) в течение 3-х мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% пектина или ксилана и культивируют при 37°С в течение 1 суток. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза пектиназ, ксиланаз, -глюканаз, галактоманнаназ, арабиназ, ксилоглюканаз и амилаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах активные клоны снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения. Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косяках с глюкозо-картофельным агаром при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма.

Толщина клеток около 1 мкм и длина 3-5 мкм, споры овальные. Колонии на питательном агаре невыпуклые, округлые, не мукоидные. Каталазоположительные. Растут в анаэробных условиях.

Специфические субстраты: гликоген, крахмал, гидролизованный крахмал, казеин, пептон, соевая мука. Энергетические субстраты: крахмал, гидролизованный крахмал, мальтоза, кукурузная и другая зерновая мука или их экструдаты, лактоза, глюкоза.

Образуют кислоты из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннозы, целлобиозы, фруктозы, лактозы и раффинозы. Цитрат не используют. Гидролизуют желатин, эскулин и крахмал, но не казеин.

Растут при температурах до 45°С. В присутствии 10% NaCl роста нет. Чувствительны к хлорамфениколу и налидиксовой кислоте, но устойчивы к полимиксину и стрептомицину.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: пектине, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, ксилоглюкане.

Полученный мутант B.macerans UV-21 (BKM B-2419D) по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного дикого штамма B.macerans сниженной интенсивностью спороношения и более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу различных карбогидраз (пектиназ, гемицеллюлаз, амилаз), при этом совсем не образуя, или образуя очень незначительное количество целлюлаз.

Данный вид бактерий не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма B.macerans UV-21 (BKM B-2419D) проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии при температуре 37-40°С, рН 7-8 в течение 24-48 часов на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов – источников углерода, азота и других питательных веществ, в качестве которых могут быть использованы природные нерастворимые субстраты, например свекловичный жом, или частично растворимые субстраты – кукурузный экстракт или гидролизат крахмала. В этих условиях наблюдается секреция в культуральную жидкость пектиназ (пектатлиазы, пектинлиазы, полигалактуроназы) и других карбогидраз – ксиланаз, -глюканаз, галактоманнаназ, арабиназ, ксилоглюканаз и амилаз.

Полигалактуроназную, ксиланазную, -глюканазную, галактоманнаназную, арабиназную, ксилоглюканазную и амилазную активности определяют по способности расщеплять соответственно полигалактуроновую кислоту (К-соль), арабиноксилан пшеницы, -клюкан ячменя, галактоманнан акации, арабинан свеклы, ксилоглюкан тамаринда и картофельный крахмал. За единицу полигалактуроназной, ксиланазной, -глюканазной, галактоманнаназной, арабиназной, ксилоглюканазной и амилазной активности принимают такое количество соответствующего фермента, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 8,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156). Пектатлиазную и пектинлиазную активности определяют по способности расщеплять соответственно полигалактуроновую кислоту и пектин. За единицу пектатлиазной и пектинлиазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 мин при 40°С и рН 8,0 приводит к образованию 1 мкмоль -4,5-ненасыщенных продуктов деструкции соответствующего субстрата, детекцию которого осуществляют спектрофотометрически на длине волны 232 нм (A.Collmer A., J.L.Ried, M.S.Mount. Methods in Enzymology. 1988, vol.161, part B, p.329-335).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Пектатлиаза, пектинлиаза, полигалактуроназа, ксиланаза, -глюканаза, галактоманнаназа, арабиназа, ксилоглюканаза и амилаза проявляют оптимум активности при рН 8,0-8,5, температуре 63-67°С, сохраняют 80-90% активности при инкубировании в течение 3 часов при 40°С и рН 8,0.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Ферментация в колбах. Посевной материал получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава (г/л): свекловичный жом – 20, кукурузный экстракт жидкий – 8, (NH₄)₂НРО₄ – 3, NaH₂PO₄ × 2H₂O – 2, Na₂CO₃ – 2, CaCl₂ – 1 (рН 7,0). Культивирование проводят в качалочных колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 37°С в течение 10 часов.

Полученный посевной материал в количестве 1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащей 100 мл питательной среды указанного выше состава. Культивирование осуществляют в аэробных условиях на качалке (240 об/мин) при температуре 40°С. Максимальная активность ферментов в культуральной жидкости наблюдается к 24-36 часам.

Пектатлиазная активность в культуральной жидкости через 36 часов составляет 120 ед./мл, пектинлиазная – 12 ед./мл, полигалактуроназная – 40 ед./мл, ксиланазная – 10 ед./мл, -глюканазная – 12 ед./мл, галактоманнаназная – 12 ед./мл, арабиназная – 8 ед./мл, ксилоглюканазная – 6 ед./мл и амилазная – 15 ед./мл.

Пример 2. Ферментация в ферментере. Посевной материал получают так же, как описано в примере 1. Процесс культивирования проводят в ферментере типа АНКУМ 2М с общим объемом 10 л и рабочим объемом 6 л, снабженного мешалкой. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере, температура – 40°С, рН 7,0, скорость перемешивания – 300 об/мин. Ферментер инокулируют 300 мл посевного материала. Состав питательной среды – тот же, что в примере 1. Максимальная активность ферментов в культуральной жидкости наблюдается к 36-48 часам.

Пектатлиазная активность в культуральной жидкости через 48 часов составляет 210 ед./мл, пектинлиазная – 18 ед./мл, полигалактуроназная – 80 ед./мл, ксиланазная – 18 ед./мл, -глюканазная – 15 ед./мл, галактоманнаназная – 15 ед./мл, арабиназная – 12 ед./мл, ксилоглюканазная – 10 ед./мл и амилазная – 25 ед./мл.

Культуральную жидкость отделяют от нерастворимых компонентов ферментационной среды с помощью центрифугирования и лиофильно высушивают. Активности сухого ферментного препарата следующие (ед./г): Пектатлиазная – 2300, пектинлиазная – 240, полигалактуроназная – 800, ксиланазная – 320, -глюканазная – 170, галактоманнаназная – 530, арабиназная – 300, ксилоглюканазная – 60 и амилазная – 510 (содержание белка в сухом ферментном препарате – 125 мг/г).

Таким образом, заявляемый штамм Bacillus macerans UV-21 BKM B-2429D обладает повышенной способностью синтеза мультиферментного комплекса, состоящего из щелочных пектиназ – пектатлиазы, пектинлиазы, полигалактуроназы (с преимущественным содержанием щелочной пектатлиазы) и щелочных карбогидраз – ксиланаз, -глюканаз, галактоманнаназ, арабиназ, ксилоглюканаз и амилаз.

Для достижения высокой активности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Высокий уровень активности щелочных пектиназ и наличие сопутствующих ферментов позволяют рассматривать штамм, как продуцент ферментативного комплекса, перспективного для применения в пищевой, текстильной, целлюлозно-бумажной отраслях промышленности, а также в производстве кормовых добавок.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus macerans BKM В-2419D – продуцент пектатлиазы, пектинлиазы и полигалактуроназы и комплекса щелочных карбогидраз, содержащего ксиланазу, – глюканазу, галактоманнаназу, арабиназу, ксилоглюканазу и амилазу.