Патент на изобретение №2323973

(54) ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Aspergillus foetidus BKM F 3890D – ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ ПРОТЕАЗЫ И КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ПЕКТИНАЗУ (ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗУ), КСИЛАНАЗУ, -ГЛЮКАНАЗУ, АРАБИНАЗУ, ГАЛАКТАНАЗУ, КСИЛОГЛЮКАНАЗУ, САХАРАЗУ, -L-АРАБИНОФУРАНОЗИДАЗУ, -ГЛЮКОЗИДАЗУ И АМИЛАЗУ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм мицелиального гриба Aspergillus foetidus BKM F 3890 D – продуцент кислой протеазы и комплекса карбогидраз, содержащего пектиназу (полигалактуроназу), ксиланазу, -глюканазу, арабиназу, галактаназу, ксилоглюканазу, сахаразу, -L-арабинофуранозидазу, – глюкозидазу и амилазу. Может быть использован в пищевой, спиртовой промышленности, в пивоварении и в качестве кормовых добавок. Изобретение позволяет увеличить выход кислой протеазы и комплекса карбогидраз.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве кормовых добавок.

Для получения указанных ферментов в промышленности используются микробные и грибные продуценты различной видовой принадлежности. Однако, несмотря на то, что грибы рода Aspergillus, как правило, образуют комплексы ферментов с широким спектром карбогидраз, компонентный состав комплексов сильно зависит от видовой принадлежности и варьирует у различных штаммов одного рода.

Известен (SU, авторское свидетельство 1445180, С12N 1/12, 1982) штамм гриба Aspergillus foetidus ВКПМ F-359 – продуцент целлюлазно-пектиназного комплекса.

Штамм получен в результате индуцированной селекции исходного штамма Aspergillus foetidus Д-73 с применением комбинированной обработки УФ-лучами, этиленимином на первой ступени (УФ-лучи: 25·10³ эрг/см², экспозиция 5 мин, ЭИ 0,5% экспозиция 30 мин) и нитрозометилмочевиной на второй ступени (1% экспозиция 30 мин). В результате двух ступеней селекции получен активный штамм Aspergillus foetidus-51, синтезирующий комплекс целлюлозолитических и пектолитических ферментов при поверхностном и глубинном способах культивирования.

При выращивании штамма A.foetidus-51 способом глубинного культивирования на питательной среде, содержащей жом свекловичный 3; ростки солодовые 1, (NH₄)₂SO₄ 0,7; КН₂PO₄ 0,1; MgSO₄·7H₂O 0,05, вода остальное – получили препарат, имеющий следующие активности: С_x 350 ед/г, АФБ 50 ед/г; -глюкозидазную 300 ед/г, ПкА 100 ед/г.

Наиболее близким аналогом выделенного штамма можно признать (SU, авторское свидетельство 1159953, С12N 9/42, 1985) штамм ASPERGILLUS FOETIDUS D – 73, продуцент ксиланазы для поверхностного культивирования. Указанный штамм зарегистрирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов института «ВНИИ генетика», коллекционный номер ЦМПМ F-222.

Штамм продуцирует систему ферментов, действующих на ксиланы различного строения и происхождения, и состоящую из эндо-1,4--ксиланазы, экзо-1,4--ксилозидазы и -h-арабинофуранозидазы. Наряду с этими ферментами штамм продуцирует эндо-1,4--манназу, расщепляющую маннаны, лихеназу, ламинариназу, -глюканы, а также ферменты, входящие в состав целлюлазного комплекса, эндо-1,4--глюканазу, C₁-экзим, целлобиазу. Штамм обладает арил -глюкозидазной активностью, продуцирует гидролитические ферменты пектолитического комплекса, обладает протеолитической и осахаривающей активностями.

Штамм получен в результате селекции исходного штамма Asp.Foetidus M-45 с применением нитрозогуанидина (концентрация 1%, экспозиция 30 минут).

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов – продуцента мультиферментгого комплекса, содержащего протеазы и широкий спектр карбогидраз, расщепляющих многие некрахмальные полисахариды (полигалактуроназы, ксиланазы, -глюканазы, галактаназы, арабиназы, ксилоглюканазы, сахаразы, -L-арабинофуранозидазы, -глюкозидазы и амилазы).

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в расширении спектра субстратов (содержащих белки, пектины, гемицеллюлозы, крахмал) и повышение эффективности их обработки при использовании ферментов предлагаемого штамма.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм мицелиального гриба Aspergillus foetidus UV 5-62 – продуцент кислой протеазы и комплекса карбогидраз, содержащего пектиназу (полигалактуроназу), ксиланазу, -глюканазу, галактаназу, арабиназу, ксилоглюканазу, сахаразу, -L-арабинофу-ранозидазу, -глюкозидазу и амилазу.

Штамм гриба A.foetidus UV 5-62 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3890D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры A.foetidus BKM F-2083. Суспензию спор исходного штамма, полученную в дистиллированной воде с добавлением 0,1% Твина-80, облучают ультрафиолетом (облучение световым потоком мощностью 3 м Вт/см²) в течение 3-х мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% казеина, пектина или крахмала, культивируют при 28°С в течение 2 суток. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза протеаз, пектиназ, ксиланаз, -глюканаз и -глюкозидазы при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах активные клоны снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения. Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 25°С, имеют диаметр 65-68 мм / 7 сут, черно-коричневые, радиально-бороздчатые, поверхность бархатистая до слабо зернистой, край ровный; мицелий тускло белый, экссудат отсутствует, обратная сторона желтовато-серая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 37°С, имеют диаметр 64-67 мм / 7 сут, коричневые, радиально-бороздчатые, поверхность бархатистая до слабо зернистой, край ровный; мицелий тускло белый, экссудат отсутствует, обратная сторона желтовато-серая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S), 25°С, имеют диаметр колонии 67-71 мм / 7 сут, коричневые, гладкие, поверхность зернистая, край ровный; мицелий тускло белый, экссудат отсутствует, обратная сторона палевая.

Колонии на Мальц-агаре (МЕА), 25°С, имеют диаметр 55-60 мм / 7 сут, черно-коричневые, слаборадиально-бороздчатые, поверхность бархатистая до слабо зернистой, край ровный; мицелий тускло белый, экссудат отсутствует, обратная сторона желтовато-серая.

Микроскопические характеристики.

Конидиальные головки шаровидные. Конидиеносцы слабо окрашены в апикальной части, гладкостенные 250-500×6-12 мкм. Везикулы (апикальные расширения) шаровидные до слегка удлиненных, 23-38 мкм в диаметре; стеригмы преимущественно двухъярусные, покрывают 2/3 поверхности везикулы, метулы – 5-13×3-6 мкм, фиалиды – 6-8×3-4 мкм. Конидии шаровидные, 2,5-4,5 мкм в диаметре, гладкостенные до слабо шероховатых при старении.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования протеаз и карбогидраз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование ферментов класса карбогидраз.

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 1,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,0-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (20-45 мкг/мл) размер колоний сильно уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу, трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу.

Не ассимилирует: L-рамнозу, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу.

Использует аммонийный и органический азот, хуже ассимилирует нитратную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: пектине, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, ксилоглюкане.

Полученный мутант A.foetidus UV 5-62 ВКМ F 3890D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма A.foetidus BKM F-2083 сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (коричневая вместо черно-коричневой) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу протеаз, пектиназ и различных карбогидраз.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма A.foetidus UV 5-62 (ВКМ F 3890D) проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов – источников углерода, азота и других питательных веществ. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы, и в присутствии индукторов (ксилозы, различных растительных отходов), секретировать в культуральную среду комплекс ферментов – кислую протеазу, полигалактуроназу, ксиланазу, -глюканазу, галактаназу, арабиназу, ксилоглюканазу, сахаразу, -L-арабинофуранозидазу, -глюкозидазу и амилазу. Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом – ферментативным гидролизатом крахмала.

Активность кислой протеазы определяют по способности гидролизовать гемоглобин. За единицу протеолитической активности (HUT) принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию в течение 30 мин количества неосаждаемого ТХУ гидролизата гемоглобина, эквивалентного 1,1 мг/мл тирозина (FOOD CHEMICALS CODEX. 4^th Ed., National Academy Press, 1996).

Полигалактуроназную, ксиланазную, -глюканазную, галактаназную, арабиназную, ксилоглюканазную, сахаразную и амилазную активности определяют по способности расщеплять соответственно полигалактуроновую кислоту (К-соль), ксилан березы, -клюкан ячменя, арабинан свеклы, ксилоглюкан тамаринда, сахарозу и картофельный крахмал. За единицу полигалактуроназной, ксиланазной, -глюканазной, галактаназной, арабиназной, ксилоглюканазной, сахаразной и амилазной активности принимают такое количество соответствующего фермента, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмоль глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

-Глюкозидазную и -L-арабинофуранозидазную активность по отношению к n-нитрофенил--глюкозиду и n-нитрофенил--L-арабинофуранозиду соответственно определяют при температуре 40°С и рН 5,0. Аликвоту (0,05 мл) запасного раствора соответствующего субстрата (10 мМ) смешивают с 0,85 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, смесь предварительно прогревают при 40°С в течение 5 мин и далее начинают ферментативную реакцию внесением 0,1 мл предварительно разбавленного и подогретого таким же образом раствора соответствующего фермента. Через 10 мин инкубации раствора при 40°С реакцию останавливают, добавляют 0,5 мл 1 М раствора Na₂СО₃. Далее на спектрофотометре измеряют поглощение раствора при 400 нм против кюветы сравнения, в которой находился контрольный раствор субстрата, приготовленный точно так же, но в который вместо раствора фермента вносят 0,1 мл ацетатного буфера. Количество выделившегося n-нитрофенола рассчитывают, используя его коэффициент экстинкции (D₄₀₀=18300 М^-1 см^-1). За единицу -глюкозидазной и -L-арабинофуранозидазной активности принимают количество соответствующего фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль n-нитрофенила за 1 мин при температуре 40°С и рН 5,0.

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Протеаза имеет максимум активности при рН 2,5-3 и температуре 47-52°С и сохраняет 100% активности при инкубировании в течение 3 часов при 30°С и рН 2,9. Полигалактуроназа, ксиланаза, -глюканаза, галактаназа, арабиназа, ксилоглюканаза, сахараза, -L-арабинофуранозидаза, -глюкозидаза и амилаза проявляют оптимум активности при рН 4-5,5 температуре 55-65°С, сохраняют 100% активности при инкубровании в течение 3 часов при 30°С и рН 4,5.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Ферментация в колбах. Посевной материал получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава (г/л): глюкоза – 10, дрожжевой экстракт – 10, (NH₄)₂SO₄ – 5, К₂HPO₄ – 1, MgSO₄×7 H₂O – 0,5 (рН 5,0). Культивирование проводят в качалочных колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 300 об/мин при 28-29°С в течение 48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащей 100 мл питательной среды следующего состава (в/л): свекловичный жом – 30, солодовые ростки – 10, (NH₄)₂SO₄ – 5, К₂HPO₄ – 1, MgSO₄×7H₂O – 0,5. Культивирование осуществляют в аэробных условиях на качалке (300 об/мин) при температуре 30°С. Максимальная активность ферментов в культуральной жидкости наблюдается к 120-144 часам.

Через 144 часа в культуральной жидкости получают следующие активности (ед/мл): кислая протеаза – 840, полигалактуроназа – 1300, ксиланаза – 130, -глюканаза – 100, галактаназа – 15, арабиназа – 25, ксилоглюканаза – 15, сахараза – 55, -L-арабинофуранозидаза – 28, -глюкозидаза – 20 и амилаза – 70.

Пример 2. Ферментация в ферментере. Посевной материал получают так же, как описано в примере 1. Процесс культивировании проводят в ферментере типа АНКУМ 2М с общим объемом 10 л и рабочим объемом 6 л, снабженного мешалкой. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере, температура – 30°С, рН 5,0, скорость перемешивания – 300 об/мин. Ферментер инокулируют 300 мл посевного материала. Состав питательной среды – тот же, что в примере 1. Максимальная активность ферментов в культуральной жидкости наблюдается к 120-144 часам.

Через 144 часа в культуральной жидкости получают следующие активности (ед/мл): кислая протеаза – 1200, полигалактуроназа – 1500, ксиланаза – 150, -глюканаза – 125, галактаназа – 20, арабиназа – 32, ксилоглюканаза – 25, сахараза – 75, -L-арабинофуранозидаза – 35, -глюкозидаза – 30 и амилаза – 80.

Культуральную жидкость отделяют от нерастворимых компонентов ферментационной среды с помощью центрифугирования и лиофильно высушивают. Активности сухого ферментного препарата следующие (ед/г): кислая протеаза – 22800, полигалактуроназа – 31500, ксиланаза – 3250, -глюканаза – 2450, галактаназа – 390, арабиназа – 420, ксилоглюканаза – 350, сахараза – 1200, -L-арабинофуранозидаза – 700, -глюкозидаза – 580 и амилаза – 1500 (содержание белка в сухом ферментном препарате – 220 мг/г).

Таким образом, заявляемый штамм Aspergillus foetidus UV 5-62 (BKM F3890D) обладает повышенной способностью синтеза мультиферментного комплекса, состоящего из кислой протеазы, полигалактуроназы, ксиланазы, -глюканазы, галактаназы, арабиназы, ксилоглюканазы, сахаразы, -L-арабинофуранозидазы, -глюкозидазы и амилазы.

Для достижения высокой активности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Высокий уровень активности синтезируемых ферментов позволяет рассматривать штамм как продуцент ферментативного комплекса, перспективного для применения в пищевой промышленности, а также в производстве кормовых добавок.

Формула изобретения

Штамм мицелиального гриба Aspergillus foetidus BKM F 3890D – продуцент кислой протеазы и комплекса карбогидраз, содержащего пектиназу (полигалактуроназу), ксиланазу, -глюканазу, арабиназу, галактаназу, ксилоглюканазу, сахаразу, -L-арабинофуранозидазу, -глюкозидазу и амилазу.