Патент на изобретение №2322991

(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛЕПРОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к лепрологии, и может быть использовано для лечения экспериментальной лепрозной инфекции. Для этого мышей заражают интраплантарно по модели Шепарда. При этом используют кормолекарственную смесь, состоящую из комбикорма, в 1 кг которого содержится 300 мг корня хрена. Активность пероксидазы в корне хрена составляет 100 Е/г. Смесь вводят в сочетании с растворами йодида калия в дозе 0,2-0,4 мг/кг и бромида калия в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела мышей. Введение осуществляют перорально ежедневно. Способ обеспечивает повышение терапевтической эффективности способа за счет увеличения антимикробного действия. 5 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”модели, патогенез, новые методы лечения, 1996. ГОЛОЩАПОВА Е.Н. Безрецидивное лечение лепры, в том числе и “сульфорезистентных форм”. Тезисы докладов девятого Всесоюзного съезда дермато-венерологов, Алма-Ата, 1991, 23-27 сент. 1991, с.182. ROJAS-ESPINOSA О. et al. The effect of exogenous peroxidase on the evolution of murine leprosy. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2002 Sep; 70(3):191-200. LONGLEY J. et al. “In vivo responses to Mycobacterium leprae: antigen presentation, interleukin-2 production, and immune cell phenotypes in naturally occurring leprosy lesions”. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1985 Sep; 53(3):385-94.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лепрологии, и может быть использовано, в частности, для лечения лепры.

К недостаткам известного способа можно отнести: недостаточный антимикробный эффект. Этот недостаток не позволяет получить конкретный технический результат – повышение терапевтической эффективности способа.

Этот способ принят авторами в качестве прототипа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу – повышение терапевтической эффективности способа.

Поставленная задача решается в изобретении тем, что в качестве терапевтического средства используют корень хрена, содержащий пероксидазу, активностью 100 Е/г в сочетании с йодидом калия в дозе 0,2-0,4 мг/кг массы тела животного и бромистого калия в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела мышей, вводимые в растворе ежедневно.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что авторы впервые для лечения экспериментальной лепрозной инфекции применили пероксидазу в составе корня хрена в комплексе с галоидами, которые повышают активность одной из основных антимикробных систем – миелопероксидазной системы фагоцитов. Повышение терапевтической эффективности способа дает возможность рекомендовать его для внедрения в лабораториях системы здравоохранения, занимающихся изучением воздействия ферментных препаратов на экспериментальную инфекцию. На основе предлагаемого способа может быть разработан способ комплексной терапии больных лепрой с использованием компонентов миелопероксидазной системы, представляющей одну из основных бактерицидных систем: пероксидазы и кофакторов (йодида и бромида).

В настоящее время много исследований посвящено изучению миелопероксидазы фагоцитирующих клеток, особенно при хронических инфекционных и гранулематозных заболеваниях, поскольку выяснено, что приобретенный или наследственный дефицит активности фермента может способствовать развитию хронических инфекционных заболеваний, инфекционных осложнений при хронических заболеваниях, либо гранулематозной болезни к которой относится лепра.

По современным представлениям, кислые гидролазы способны разрушить в фаголизосомах фагоцитов только те бактерии, которые были умерщвлены миелопероксидазной системой, неферментными катионными белками, лизоцимом и лактоферрином. При выраженной недостаточности миелопероксидазы фагоцитов, последние не способны убивать грибы рода кандида, стафилококки и другие патогенные микроорганизмы.

Анализируя литературные данные, можно с большой степенью достоверности считать, что такой показатель бактерицидной системы фагоцитов, как активность миелопероксидазы, является надежным критерием оценки их фагоцитарной способности.

Ранее авторами выявлено, что лиофилизированная пероксидаза из корня хрена, также как и корень хрена, в экспериментально подобранных эффективных дозировках повышают активность фагоцитов ввиду стимулирования миелопероксидазной системы фагоцитов (в ходе лечения повышается активность миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов). Известно, что миелопероксидаза обладает антибактериальными свойствами, действуя совместно с перекисью водорода и галоидами, из которых наиболее эффективным считается йодид и менее эффективным бромид. Концентрация йодида в сыворотке крови значительно ниже той, которая необходима для осуществления эффективного действия миелопероксидазной системы. С переходом йода в положительную одновалентную форму он проявляет наибольшую антибактериальную активность, а миелопероксидаза в присутствии даже небольших количеств перекиси водорода переводит йод в это высокоактивное состояние. Система миелопероксидаза-Н₂O₂

Способ осуществляется следующим образом: подопытных мышей линии СВА с начальным весом 25-30 г заражали интраплантарно (в подушечку правой задней лапы) взвесью M.leprae, выделенных от больных и пассированных на экспериментальных животных (модель лепры по Шепарду). Доза инфекта составила 1×10⁴ микробных тел в 0,03 мл взвеси.

В связи с тем что в опытах использовались микобактерии лепры, выделенные от разных больных (т.е. разные штаммы), интенсивность размножения микобактерии в лапах мышей может варьировать в зависимости от штамма. В рамках одного примера использовался один штамм микобактерии лепры.

Спустя 2 мес после заражения, мышам давали кормолекарственную смесь, состоящую из комбикорма, в 1 кг которого содержалось выявленная нами ранее эффективно действующая доза корня хрена (300 мг), активность пероксидазы в котором составила 100 Е/г, а также йодид и бромид калия в водном растворе. Корень хрена (КХ) сушили при комнатной температуре, резали на мелкие кусочки и мололи в обычной электрической кофемолке. Кормолекарственную смесь приготовляли в миксере Rotomixer (Англия).

Для контроля использовали мышей той же линии и с тем же начальным весом. Одной группе контрольных мышей после заражения тем же штаммом и той же дозой микобактерий лепры давали кормолекарственную смесь, состоящую из комбикорма в 1 кг которого содержалось 100 мг порошка диаминодифенилсульфона (DDS) (основной препарат, использующийся для лечения лепры). Другая группа контрольных мышей после заражения не получала лечения. Способ позволяет повысить фагоцитарную активность макрофагов в лапах животных, что приводит к повышению терапевтической эффективности по сравнению с известным способом.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в ФГУ “НИИ по изучению лепры Росздрава” на 600 мышах линии СВА с первоначальным весом 25-30 г.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. 50 мышей заражали как указано выше взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного К. (ист. бол. №2662) и пассированных двукратно на мышах.

Через 2 мес после заражения мышам давали кормолекарственную смесь с КХ. Одновременно мыши получали в растворе ежедневно йодид калия в дозе 0,2 мг/кг массы и бромид калия в дозе 0,1 мг/кг массы. В качестве контроля группе мышей (50 животных) давали кормолекарственную смесь, содержащую 100 мг порошка DDS в 1 кг комбикорма. Третья группа мышей (50 животных), зараженных интраплантарно той же взвесью и той же дозой микобактерий лепры, не получала лечения (контроль).

Мышей забивали декапитацией группами опыт-контроли по 5-6 животных из группы в сроки через 3, 6 и 9 месяцев после лечения. Количество микобактерий лепры в лапах мышей подсчитывали по методу Шепарда и МакРе. Активность миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (НГ) периферической крови мышей – полуколичественным методом Астальди и Верга.

Результаты подсчета количества микобактерий лепры в лапах мышей и уровень миелопероксидазы (МП) представлены в табл.1.

Комбинированная терапия KX+KI+KBr (I группа) уже через 3 мес лечения приводила к значительному подавлению роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к контролю и по отношению к монотерапии DDS в 2,7 раза. Через 6 и 9 мес лечения комбинация препаратов оказывала антимикробное действие, статистически превышающее эффект монотерапии DDS (p<0,001).

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных комплексом препаратов, выявлено по сравнению с контролем повышение активности внутриклеточной МП (табл.).

Таким образом, лечение экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей комплексом KX+KI+KBr в дозе KI 0,2 мг/кг и KBr 0,1 мг/кг массы мыши приводит к достоверному снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем, что является показателем активизации процессов завершенного фагоцитоза микроорганизмов. В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и DDS.

Пример 2. Условия эксперимента аналогичны примеру 1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного Б. (ист. бол. №3865) и пассированных трехкратно на мышах. 1-й группе мышей после заражения давали кормолекарственную смесь, содержащую препараты, как показано в примере 1, но йодистый и бромистый калий давали в дозах 0,3 мг/кг и 0,15 мг/кг массы животных в сутки соответственно. Контроль осуществлялся аналогично примеру 1. Животных забивали через 3, 6 и 9 мес с момента лечения. Подсчитывали количество микобактерий в лапах мышей и уровень активности МП в НГ периферической крови мышей способом, указанным в примере 1.

Результаты представлены в табл.2.

Через 3 мес лечения комбинированная терапия KX+KI+KBr (I группа) приводила к значительному подавлению роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к нелеченому контролю и по отношению к монотерапии DDS в 3,9 раза. Через 6 и 9 мес лечения комбинация препаратов оказывала антимикробное действие, статистически превышающее эффект монотерапии DDS (р<0,05).

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных комплексом препаратов, выявлено по сравнению с контролем повышение активности внутриклеточной МП (табл.).

Таким образом, лечение экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей комплексом KX+KI+KBr в дозе KI 0,3 мг/кг и KBr 0,15 мг/кг массы мыши приводит к достоверному снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем, что является показателем активизации процессов завершенного фагоцитоза микроорганизмов. В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и DDS.

Пример 3. Условия эксперимента аналогичны примеру 1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного Б. (ист. бол. №3865) и пассированных трехкратно на мышах. 1-й группе мышей после заражения давали кормолекарственную смесь, содержащую препараты, как показано в примере 1, но йодистый и бромистый калий давали в дозах 0,4 мг/кг и 0,2 мг/кг массы животных в сутки соответственно. Контроль осуществлялся аналогично примеру 1. Животных забивали через 3, 6 и 9 мес с момента лечения. Подсчитывали количество микобактерий в лапах мышей и уровень активности миелопероксидазы в НГ периферической крови мышей способом, указанным в примере 1.

Результаты представлены в табл.3.

Через 3 мес лечения комбинированная терапия KX+KI+KBr (I группа) приводила к значительному подавлению роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к контролю и по отношению к монотерапии DDS в 3,5 раза. Через 3 и 9 мес лечения комбинация препаратов оказывала антимикробное действие, статистически превышающее эффект монотерапии DDS (Р<0,05).

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных комплексом препаратов, выявлено по сравнению с контролем повышение активности внутриклеточной МП (табл.).

Таким образом, лечение экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей комплексом KX+KI+KBr в дозе KI 0,4 мг/кг и KBr 0,2 мг/кг массы мыши приводит к достоверному снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем, что является показателем активизации процессов завершенного фагоцитоза микроорганизмов. В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и DDS.

Пример 4. Условия эксперимента аналогичны примеру 1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного К. (ист. бол. №3866) и пассированных двухкратно на мышах. 1-й группе мышей после заражения давали кормолекарственную смесь, содержащую препараты, как показано в примере 1, но йодистый и бромистый калий давали в дозах 0,1 мг/кг и 0,05 мг/кг массы животных в сутки соответственно. Контроль осуществлялся аналогично примеру 1. Животных забивали через 3, 6 и 9 мес с момента лечения. Подсчитывали количество микобактерий в лапах мышей и уровень активности МП в НГ периферической крови мышей способом, указанным в примере 1.

Результаты представлены в табл.4.

Из табл.4 видно, что через 3 и 6 мес лечения количество M.leprae в лапах мышей, леченных комплексом KX+KI+KBr и DDS, было практически одинаковым. Через 9 мес лечения меньшее количество M.leprae обнаруживалось в лапах мышей, леченных комплексом препаратов по сравнению с нелечеными мышами и в 1,5 раза ниже леченных препаратом DDS.

Таким образом, лечение экспериментально зараженных M.leprae мышей содержащим пероксидазу корнем хрена в сочетании с йодистым и бромистым калием в приведенных дозах приводит к снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с лечением DDS и контролем, что является показателем активизации процессов завершенного фагоцитоза микроорганизмов. В этом случае отмечено некоторое преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом (лечение только КХ) и не отмечено преобладания по сравнению с основным препаратом для лечения лепры – DDS.

Пример 5. Условия эксперимента аналогичны примеру 1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного Б. (ист. бол. №3865) и пассированных двукратно на мышах. 1-й группе мышей после заражения давали препараты, как показано в примере 1, но йодистый и бромистый калий давали в дозах 3 мг/кг и 1.5 мг/кг массы животных в сутки соответственно (т.е. в 15 раз больше, чем в примере 1). Контроль и показатели определялись аналогично предыдущим примерам.

Результаты представлены в табл.5.

Через 3 мес лечения комбинированная терапия KX+KI+KBr (I группа) приводила к значительному подавлению роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к нелеченому контролю и по отношению к монотерапии DDS в 1,7 раза. Через 6 и 9 мес лечения комбинация препаратов оказывала антимикробное действие, статистически превышающее эффект монотерапии DDS (р<0,05).

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных комплексом препаратов, выявлено по сравнению с контролем повышение активности внутриклеточной МП (табл.).

Таким образом, лечение экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей комплексом KX+KI+KBr в дозе KI 3 мг/кг и KBr 1,5 мг/кг массы мыши приводит к достоверному снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем, что является показателем активизации процессов завершенного фагоцитоза микроорганизмов. В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и DDS. Однако в этом случае отмечен несколько худший антибактериальный эффект по сравнению с первыми тремя примерами и, по мнению ряда авторов, высокие дозы йодистого калия могут вызвать отравление.

Таким образом, анализ приведенных примеров показывает, что лучшие результаты в отношении подавления роста микобактерий лепры в подушечках лап мышей (антимикробный эффект) достигаются при лечении экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей КХ в виде пищевой добавки, содержащей пероксидазу 100 Е/г в сочетании с йодистым и бромистым калием в дозах 0,2-0,4 и 0,1-0,2 мг/кг массы животного соответственно, вводимые в растворе ежесуточно, что приводит к снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем (мыши без лечения) и по сравнению с лечением. При снижении дозы йодистого и бромистого калия в 2 раза отмечен худший терапевтический эффект по сравнению с прототипом.

При повышении доз йодистого и бромистого калия отмечался и несколько лучший, но статистически малозаметный антибактериальный эффект по сравнению с приведенной вначале дозой.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что ранее ферментотерапия пероксидазой, содержащейся в КХ, в сочетании с кофакторами миелопероксидазной бактерицидной системы (йодидом и бромидом) экспериментальной лепрозной инфекции не проводилась. Предлагаемым способом достигается повышение терапевтической эффективности способа по сравнению с прототипом (лечение только КХ).

Примененное в заявляемом способе терапевтическое воздействие пероксидазой, содержащейся в корне хрена, в совокупности с йодидом и бромидом (по данным проведенных авторами исследований повышающее фагоцитарные способности макрофага) является существенным отличием в подходе к лечению экспериментальной лепрозной инфекции.

Это отличие позволило получить положительный результат в виде:

– значительного подавления роста микобактерий лепры в подушечках лап мышей с экспериментальной лепрозной инфекцией по сравнению с прототипом;

– отсутствия побочного действия, поскольку корень хрена является растительным продуктом и широко используется в быту.

Предлагаемый способ позволяет повысить активность завершенного фагоцитоза M.leprae в макрофагах животных, что приводит к повышению терапевтической эффективности по сравнению с известным способом.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для внедрения в лабораториях системы здравоохранения, занимающихся изучением воздействия ферментных препаратов на экспериментальную инфекцию.

На основе предлагаемого способа может быть разработан способ комплексной терапии больных лепрой с использованием компонентов миелопероксидазной системы, представляющей одну из основных бактерицидных систем: пероксидазы и кофакторов (йодида и бромида).

Формула изобретения

Способ лечения экспериментальной лепрозной инфекции, состоящий в подавлении размножения микобактерий лепры в лапах мышей, зараженных интраплантарно по модели Шепарда, отличающийся тем, что в качестве терапевтических средств используют кормолекарственную смесь, состоящую из комбикорма, в 1 кг которого содержится 300 мг корня хрена, при активности пероксидазы 100 Е/г, в сочетании с растворами йодида калия в дозе 0,2-0,4 мг/кг и бромида калия в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела мышей, введение осуществляют перорально ежедневно.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 26.07.2008

Извещение опубликовано: 10.07.2010 БИ: 19/2010