Патент на изобретение №2322508

(54) СПОСОБ АНАЛИЗА НЕИЗВЕСТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для анализа нуклеиновых кислот. Последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты анализируют путем секвенирования продуктов ее амплификации. Для амплификации нуклеиновой кислоты используют праймеры, специфичные к двухцепочечным адаптерам, с которыми указанную нуклеиновую кислоту предварительно лигируют. Реакцию лигирования проводят при концентрации анализируемой нуклеиновой кислоты, равной 0,3-3,0 пг/мкл. Применение изобретения позволяет анализировать неизвестные последовательности одноцепочечных нуклеиновых кислот, присутствующих в растворе в низкой концентрации. 2 табл.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к разработке способа анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот.

Разработка способа анализа неизвестных последовательностей нуклеиновых кислот (НК) с низкой концентрацией в образце является актуальной задачей в молекулярной биологии, поскольку такой способ необходим для клонирования коротких фрагментов НК, малых интерферирующих РНК и микроРНК.

Известен способ анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот путем лигирования адаптеров – олигонуклеотидов с известной первичной последовательностью с использованием фермента Т4 РНК-лигазы [Tessier DC, Brousseau R, Vernet Т., Anal Biochem., 1986, v.158, p.171-178], который применяется для лигирования одноцепочечных субстратов.

Недостатками известного способа являются его ограниченные функциональные возможности, поскольку его реализация возможна при условии, что в составе исследуемой нуклеиновой кислоты с неизвестной последовательностью должен отсутствовать 5-концевой фосфат, а также в образце должна присутствовать НК в высокой концентрации от 20 до 60 пг/мкл. При более низкой концентрации исследуемой НК выход продукта лигирования существенно уменьшается.

Известен способ анализа одноцепочечных коротких РНК с неизвестной последовательностью, основанный на полиаденировании РНК с использованием поли-(А) РНК полимеразы, с последующим синтезом цепи кДНК при помощи поли-(Т) праймера. Далее к полученной цепи кДНК с 3-конца достраивают поли-(G) последовательность с использованием специфической дезоксинуклеотидил-трансферазы, а затем осуществляют амплификацию фрагментов НК с участием поли-(Т) и поли-(С) праймеров, с последующим клонированием и секвенированием [Wang JF, Zhou H, Chen YQ, Nucleic Acids Res., 2004, v.32, p.1688-1695].

Недостатками известного способа являются:

– исследуемый образец должен содержать анализируемую последовательность нуклеиновой кислоты в высокой концентрации;

– дополнительные ферментативные реакции понижают выход продукта;

– поли-(А) РНК полимераза и специфическая дезоксинуклеотидил-трансфераза являются редкими и дорогими ферментами, что приводит к удорожанию способа.

Лигазная реакция, осуществляемая ферментами Т4 ДНК-лигазой или Т4 РНК-лигазой, лежит в основе стандартного подхода, используемого для анализа последовательностей НК, заключающегося в присоединение к 3– и 5-концам исследуемой нуклеиновой кислоты адаптеров – олигонуклеотидов с известной первичной последовательностью. Однако в случае низких концентраций неизвестной последовательности НК использование этих ферментов не позволяет лигировать неизвестную последовательность исследуемой НК с адаптерами – олигонуклеотидами с известной первичной последовательностью.

Наиболее ближайшим к заявленному способу – прототипом является способ анализа неизвестных последовательностей фрагментов одноцепочечных нуклеиновых кислот [Edwards JB, Delort J, Mallet J Nucleic Acids Res., 1991, v.19, p.5227-5232], включающий:

– синтез кДНК с матрицы РНК (100-10 нг) с использованием праймера к известной последовательности 3′-области матрицы РНК при помощи ревертазы [Rhyner ТА, Biguet NF, Berrard S, Borbely AA, Mallet J., J. Neurosci Res., 1986, v.16, p.167-181];

– синтез адаптера, фосфорилированного по 5-концу и по 3-концу, несущего дидезоксинуклеотид с использованием терминальной трансферазы с последующим выделением модифицированного адаптера из реакционной смеси;

– лигирование фосфорилированного адаптера к синтезированной кДНК в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCl буфер (рН=8,0), 10 мМ MgCl₂, 10 мкг/мл BSA, 25% полиэтиленгликоля и 20 мкМ АТР, с добавлением 1/10 части от полученной кДНК и 0,5 мкл фосфорилированного адаптера с концентрацией 5 нг/мкл, с последующим добавлением 10 Unit T4 РНК-лигазы и инкубированием реакционной смеси в течение 24-48 часов при 22°С.

Продукт лигирования, состоящий из исследуемой НК и адаптеров, амплифицируют методом ПЦР с использованием праймеров, комплементарных адаптерам, с последующим клонированном и секвенированием последовательностей исследуемых НК.

Недостатками данного способа являются необходимость использования высоких концентраций исследуемой нуклеиновой кислоты, использование редких реагентов и дорогих ферментов, таких как дидезоксинуклеотидтрифостфат и терминальная трансфераза, большая длительность стадии лигирования и ограниченность способа для получения копии кДНК только к протяженным молекулам РНК с известной первичной последовательностью.

Технической задачей изобретения является повышение эффективности лигирования нуклеиновых кислот и их компонентов различного размера в условиях с низкой концентрацией НК в растворе и удешевление способа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующих последовательных стадиях:

1) фосфорилирование 5-конца неизвестной последовательности исследуемой НК при помощи Т4-полинуклеотидкиназы, с последующим выделением фосфорилированной НК из полиакриламидного или агарозного геля.

2) лигирование 3-конца исследуемой НК с 5-концевым фосфатом короткого олигонуклеотида (3-концевой адаптер), входящего в состав дуплекса. В составе дуплекса короткий олигонуклеотид комплементарен 5-концевой области длинного, а свободная (3-концевая) часть длинного олигонуклеотида представляет собой рандомизованную последовательность из 4-6 оснований. Последовательность короткого и комплементарного ему фрагмента длинного олигонуклеотида содержит сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции, а 3-концы обоих олигонуклеотидов блокированы защитными группами.

Для лигирования используют неизвестную последовательность исследуемой НК в концентрации 0,3-3 пг/мкл и дуплекс олигонуклеотидов в концентрации 10-50 пг/мкл в буфере для Т4 ДНК-лигазы, далее добавляют 20 Units T4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь объемом 20 мкл инкубируют в течение 8-10 часов при 11-13°С, эффективность реакции лигирования составляет 90%.

3) Лигирование 5-конца исследуемой НК, содержащей с 3-конца адаптер с коротким олигонуклеотидом (5-концевого адаптера), входящим в состав дуплекса. В составе дуплекса короткий олигонуклеотид комплементарен 3-концевой области длинного, а свободная (5-концевая) часть длинного олигонуклеотида представляет собой рандомизованную последовательность из 4-6 оснований. Последовательность короткого и комплементарного ему фрагмента длинного олигонуклеотида содержат сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции, а 3-конец длинного олигонуклеотида блокирован защитной группой.

Для лигирования адаптера к 5-концу исследуемой НК, содержащей с 3-конца адаптер, используют реакционную смесь, аналогичную используемой на 2 стадии способа и добавляют дуплекс олигонуклеотидов в концентрации 10-50 пг/мкл, затем добавляют 18 Units T4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь инкубируют в течение 10-14 часов при 11-13°С, эффективность реакции лигирования составляет 80%.

4) Выделение продукта лигирования, состоящего из исследуемой нуклеиновой кислоты, фланкированной адаптерами на 5– и 3-концах.

5) Амплификация исследуемой неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, фланкированной адаптерами по 5– и 3-концам при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров, комплементарных 5– и 3-концевым адаптерам.

В случае анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных РНК стадию фосфорилирования 5-конца неизвестной последовательности исследуемой РНК при помощи Т4-полинуклеотидкиназы не осуществляют, но дополнительно проводят синтез кДНК с матрицы РНК с использованием праймера, комплементарного к 3-концевому адаптеру при помощи ревертазы.

Способ позволяет нарабатывать при помощи ПЦР, клонировать и секвенировать неизвестные последовательности одноцепочечных нуклеиновых кислот в низкой концентрации, составляющей 0,3-3 пг/мкл. Эффективность лигирования на двух стадиях составляет 90% и 80%, что обеспечивает получение исследуемых нуклеиновых кислот, фланкированных адаптерами с эффективностью 60-70%. Полученный продукт лигирования, состоящий из неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, фланкированной адаптерами на 5– и 3-концах, может быть амплифицирован методом ПЦР для последующего исследования.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. Перед стадией лигирования ДНК (или их компоненты) фосфорилируют по 5-концу при помощи Т4-полинуклеотидкиназы, что позволяет лигировать адаптеры по 5-концу исследуемой ДНК.

2. Для лигирования одноцепочечных НК используют двуцепочечные взаимнокомплементарные олигонуклеотиды, содержащие сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции, в которых один олигонуклеотид длиннее другого на фрагмент из 4-6 нуклеотидов с 5– или 3-конца, причем этот фрагмент представляет собой рандомизованную последовательность оснований. В условиях реакции происходит взаимодействие концевого участка исследуемой нуклеиновой кислоты с комплементарной ему последовательностью, присутствующей в составе рандомизованной последовательности длинного олигонуклеотида, и сближение концов нуклеиновых кислот, необходимое для эффективного лигирования.

3. Для лигирования одноцепочечных НК с неизвестной последовательностью используют Т4 ДНК-лигазу, что позволяет увеличить эффективность лигирования по сравнению с использованием Т4 РНК-лигазы, а также удешевить способ.

4. В качестве адаптеров для лигирования используют дуплексы олигонуклеотидов с одноцепочечным рандомизованным фрагментом на 3– и 5-концах олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды с одноцепочечным рандомизованным фрагментом и фосфорилированный короткий олигонуклеотид модифицированы по 3-концу диэтиленгликолем, аминоспейсером или другой защитной группой. Введение защитных групп по 3– концам олигонуклеотидов, входящих в дуплексы, позволяет увеличить эффективность лигирования.

5. Экспериментально подобранный оптимальный режим лигирования, а именно: лигирование проводят при концентрации исследуемой НК, равной 0,3-3 пг/мкл, в присутствии 18-20 Units T4 ДНК-лигазы при 11-13°С в течение 8-14 часов, что позволяет эффективно лигировать НК с неизвестной последовательностью в образце с низкой концентрацией.

Для исключения стадии выделения продукта лигирования из реакционной смеси могут быть использованы дуплексы, в которых олигонуклеотид с рандомизованным фрагментом короче 15 нуклеотидов, а прочность дуплекса обеспечивается тандемным олигонуклеотидом, который комплементарен адаптеру.

Увеличение эффективности лигазной реакции позволяет анализировать неизвестную последовательность нуклеиновых кислот, концентрация которых составляет 0,3-3 пг/мкл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Анализ неизвестной последовательности дезоксирибоолигонуклеотида.

Лигирование по 3-концу исследуемого дезоксирибоолигонуклеотида Х с фосфолирированным по 5-концу коротким олигонуклеотидом 1 из состава дуплекса, состоящего из взаимокомплементарных олигонуклеотидов 1 и 2:

К олигонуклеотиду Х в концентрации 0,5 пг/мкл в трис-EDTA буфере (рН=7,5) добавляли дуплекс, состоящий из олигонуклеотидов 1 и 2 в концентрации 30 пг/мкл в трис-EDTA буфере (рН=7,5), затем добавляли буфер для лигирования (40 мМ трис-HCl (рН=7,8), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреит, 5 мМ АТР) и 18 Units T4 ДНК-лигазы, объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Инкубировали смесь в течение 10 часов при 11°С, затем продукт реакции был использован для лигирования по 5-концу исследуемого олигонуклеотида Х с фланкирующим адаптером по 3-концу.

Лигирование фосфорилированного по 5-концу исследуемого олигонуклеотида Х с фланкирующим адаптером по 3-концу коротким олигонуклеотидом 3 из состава дуплекса, состоящего из взаимокомплементарных олигонуклеотидов 3 и 4:

К олигонуклеотиду Х с фланкирующим адаптером по 3-концу в концентрации 0,5 пг/мкл в трис-EDTA буфере (рН=7,5) добавляли дуплекс из олигонуклеотидов 3 и 4 в концентрации 40 пг/мкл в трис-EDTA буфере (рН=7,5), затем добавляли буфер для лигирования (40 мМ трис-HCl (рН=7,8), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреит, 5 мМ АТР) и 20 Units T4 ДНК-лигазы, объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Инкубировали смесь в течение 14 часов при 11°С, затем продукт лигирования был выделен электроэлюцией из полиакриламидного геля.

Продукт лигирования наработатывали при помощи ПЦР со специфическими праймерами 1 и 2, затем определяли первичную последовательность олигонуклеотида Х при помощи секвенирования.

Последовательности олигонуклеотидов, использованных в примере 1 приведены в таблице 1:

обозначение	последовательность
олигонуклеотид Х	5pATTCGATCGGTATACCC3
олигонуклеотид 1	5pACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3
олигонуклеотид 2	5CCTGGATCCTTCTTCCCACTACTACGTNNNNNdeg3
олигонуклеотид 3	5TTCGAATTCTACCTCGCGCGATCTAC3
олигонуклеотид 4	5NNNNNGTAGATCGCGCGAGGTAGAATTCGAAdeg3
праймер 1	5CCTGGATCCTTCTTCCCACTA3
праймер 2	5TTCGAATTCTACCTCGCGCG3
deg – диэтиленгликоль, в качестве защитной группы.

Данный пример иллюстрирует, что разработанный способ может быть использован для анализа фрагмента одноцепочечной нуклеиновой кислоты с неизвестной последовательностью.

Пример 2.

Анализ неизвестной последовательности одноцепочечной РНК.

Для лигирования адаптера к 3-концу исследуемой РНК использовали РНК в концентрации 3 пг/мкл и дуплекс взаимокомплементарных олигонуклеотидов 1 и 2, как в примере 1, в концентрации 50 пг/мкл в 15 мкл буфера для T4 ДНК-лигазы, добавили 18 Units T4 ДНК-лигазы. После инкубации реакционной смеси в течение 8 часов при 13°С продукт лигирования выделяли и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием ревертазы по протоколу, описанному в [Chandler DP, Wagnon CA, Bolton H Jr., Appl Environ Microbiol; 1998, v.64, p.669-677.]. Затем к 3-концу синтезированной кДНК лигировали адаптер, из состава дуплексов взаимокомплементарных олигонуклеотидов, 5pGTAGATCGCGCGAGGTAGAATTCGAAdeg3 и 5TTCGAATTCTACCTCGCGCGATCTACNNNNNdeg3. При помощи амплификации фрагмента, содержащего исследуемую НК, нарабатывали достаточное количество образца НК с ипользованием праймеров, комплементарных адаптерам. Фрагмент НК встраивали в плазмиду pBluescript II, с последующим секвенированием полученных клонов известным способом [Wang JF, Zhou H, Chen YQ, Luo QJ, Qu LH, Nucleic Acids Res., 2004, v.32, p.1688-1695].

Пример 3.

Анализ неизвестной последовательности одноцепочечной ДНК.

Лигирование адаптеров к концам одноцепочечной ДНК проводили в условиях аналогично примеру 1, за исключением того, что брали ДНК (300 нуклеотидов) в концентрации 1,5 пг/мкл и использовали дуплексы в концентрации 50 пг/мкл, состоящие из трех олигонуклеотидов: адаптера и олигонуклеотида с рандомизованным фрагментом и тандемного олигонуклеотида, который обеспечивает прочность дуплекса. При использование такой структуры дуплекса продукт лигирования не нужно выделять из реакционной смеси. Данный продукт затем наработатывали при помощи ПНР со специфическими праймерами 1 и 2, затем определяли первичную последовательность одноцепочечной ДНК при помощи секвенирования.

Последовательности олигонуклеотидов, использованных в примере 3, приведены в таблице 2:

обозначение	последовательность
3-концевой адаптер	5pACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGam3
олигонуклеотид с рандомизованным фрагментом	5CTACTACGTNNNNNam3
тандемный олигонуклеотид	5атСТТСТТСССАат3
5-концевой адаптер	5TTCGAATTCTACCTCGCGCGATCTAC3
олигонуклеотид с рандомизованным фрагментом	5NNNNNGTAGATCGCGam3
тандемный олигонуклеотид	5amCGAGGTAGAATTCGAAam3
праймер 1	5CCTGGATCCTTCTTCCCACTA3
праймер 2	5TTCGAATTCTACCTCGCGCG3
am – диаминогептан, в качестве защитной группы.

Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:

– повысить эффективность лигазной реакции в образцах, содержащих нуклеиновую кислоту в концентрации 0,3-3 пг/мкл;

– расширить область применения Т4 ДНК-лигазы при лигировании одноцепочечных нуклеиновых кислот;

– лигировать адапторные олигонуклеотиды к НК различного размера;

– удешевить способ анализа одноцепочечных НК.

Формула изобретения

Способ анализа первичной структуры одноцепочечных нуклеиновых кислот с неизвестными нуклеотидными последовательностями, включающий лигирование исследуемой одноцепочечной нуклеиновой кислоты с адаптерами, амплификацию продукта лигирования при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, комплементарных указанным адаптерам, и секвенирование ампликона, отличающийся тем, что в качестве адаптеров используют двухцепочечный олигонуклеотид с одноцепочечным рандомизированным выступом из 4-6 нуклеотидов на 3-конце, в котором обе цепи на 3-конце содержат защитную группу, (адаптер 1) и двухцепочечный олигонуклеотид с одноцепочечным рандомизированным выступом из 4-6 нуклеотидов на 5-конце, в котором цепь с рандомизированным 5-концом на 3-конце содержит защитную группу, (адаптер 2), перед лигированием 5-конец короткой цепи адаптера 1 и 5-конец исследуемой нуклеиновой кислоты фосфорилируют при помощи Т4-полинуклеотидкиназы, реакцию лигирования проводят при концентрации анализируемой нуклеиновой кислоты, равной 0,3-3,0 пг/ мкл в присутствии 18-20 Units T4 ДНК-лигазы при 11-13°С в течение 8-14 ч.