Патент на изобретение №2322505

(54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропептидом этого белка, выделение белка элюцией из полученного комплекса. На первом этапе приготовления комплекса получают иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка. На втором этапе приготовления комплекса осуществляют контакт выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте его пропептидом путем пропускания раствора этого белка через заполненную колонку. Способ позволяет расширить ассортимент средств, применяемых для выделения и очистки белков, упростить процесс, повысить его эффективность за счет повышения выхода целевого продукта. 6 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биохимии, биотехнологии и касается приемов по выделению и очистке белков.

Для выделения и очистки белков из многокомпонентных смесей широко применяются хроматографические приемы.

Однако этот известный способ сложен: он включает две стадии анионообменной хроматографии (в том числе одну стадию высокоэффективной), при этом выход очищенного белка низкий.

Однако при использовании этого многостадийного способа выделенный и очищенный белок получают с низким выходом.

Данный известный способ включает две стадии катионообменной хроматографии (в том числе одну высокоэффективную), но при этом позволяет получить очищенный белок с низким выходом.

В качестве пептидного соединения в этом известном способе используют, например, антибиотики пептидной природы.

Однако данные известные иммобилизованные соединения пептидной природы не обеспечивают высокой избирательности при очистке конкретных белков.

Согласно данному известному способу осуществляют двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка и иммобилизованного на сорбенте пропептида этого белка. На первом этапе готовят продукт взаимодействия выделяемого и очищаемого белка с пропептидом этого белка. На втором этапе готовят упомянутый комплекс путем осуществления контакта с сорбентом полученного продукта взаимодействия, выделение исходного белка из полученного комплекса осуществляют путем его элюции из этого комплекса.

Однако данный известный способ сложен и не позволяет получать выделяемый и очищаемый белок с высоким выходом. Согласно этому способу иммобилизованный на сорбенте пропептид не подлежит многократному использованию.

В информационном источнике [5] описано получение иммобилизованного на сорбенте пропептида белка, однако его использование для выделения и очистки этого белка не описано.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является упрощение, повышение эффективности очистки и выхода выделяемого и очищаемого белка, обеспечение возможности многократного использования иммобилизованного на сорбенте пропептида.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе хроматографического выделения и очистки белка, включающем двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропептидом этого белка, и последующее выделение белка элюцией из полученного комплекса, на первом этапе приготовления комплекса получают иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка, который помещают в колонку с получением заполненной колонки, на втором этапе приготовления комплекса осуществляют контакт выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте его пропептидом путем пропускания раствора этого белка через заполненную колонку, а элюцию очищенного белка осуществляют из колонки.

Выделять и очищать можно природный рекомбинантный, мутантный или модифицированный белок.

Можно использовать природный рекомбинантный, мутантный или модифицированный пропептид выделяемого и очищаемого белка.

Если выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, то используют ее природный пропептид, иммобилизованный на агарозе, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ трис-(гидроксиметил)аминометан-HCl (ТРИС-HCl) буферном растворе pH 7,5.

Если выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, то можно также использовать иммобилизованный на агарозе ее модифицированный пропептид, несущий дополнительную последовательность из 6 остатков гистидина на амино-конце молекулы, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,0.

Если выделяют и очищают глутамилэндопептидазу, продуцируемую Bacillus intermedius, то используют ее иммобилизованный на микрокристаллической целлюлозе модифицированный пропептид, несущий на амино-конце молекулы целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы, продуцируемой Anaerocellum thermophilum, а элюируют глутамилэндопептидазу с колонки 0,5 М раствором NaCl в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,5.

Если выделяют и очищают субтилизин, то используют иммобилизованный на агарозе его пропептид с мутацией Glu⁵³-Asp, а элюируют субтилизин с колонки раствором его пропептида с мутацией Glu⁵³-Asp в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,3.

Собственные исследования показали, что процесс выделения и очистки белка можно упростить и в одну стадию получить с высоким выходом выделяемый и очищаемый белок, если очистку осуществлять колоночной хроматографией, используя для заполнения колонки иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка.

В тех случаях, когда получение природного пропептида связано с трудностями, можно использовать иммобилизованный рекомбинантный пропептид. Для повышения эффективности хроматографического выделения и очистки белка можно прибегать к использованию модифицированного пропептида. Модификации могут быть направлены на изменение сродства пропептида к целевому белку или на введение дополнительных структурных элементов, облегчающих иммобилизацию пропептида.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1. Очистка природной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а с использованием пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Суспендировали 2 г CNBr-активированной агарозы в 10 мл холодной (4°C) 1 мМ HCl. Сорбент промыли на стеклянном фильтре 400 мл холодной (4°C) 1 мМ HCl и затем перенесли в 8 мл раствора природного пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a (1 мг/мл) в 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3). Для получения иммобилизованного пропептида (сорбента) полученную смесь инкубировали при перемешивании 16 ч при 4°C, после чего полученный сорбент переносили в 0,2 М раствор глицина (pH 8,0) и выдерживали 2 ч при 20°C. Сорбент промыли 5 раз попеременно 50 мл 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3) и 50 мл 0,1 М уксусной кислоты, 0,5 М NaCl (pH 4), а затем 100 мл 50 мМ трис-(гидроксиметил)аминометан-HCl (ТРИС-HCl) буферного раствора (pH 7,5). Полученную агарозу с иммобилизованным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a (2 мг/мл сорбента) использовали для очистки металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Для этого через колонку (1,5×2 см) с иммобилизованным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Thermoactinomyces species 27a. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствором (pH 7,5), содержащего 300 мМ NaCl. Очищенный белок элюировали 10% раствором изопропанола в том же буфере.

Выход очищенной металлопротеиназы в 3,5 раза превышал ее выход при использовании известного способа [1]. При этом процесс проходит в одну стадию.

Пример 2. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a с использованием модифицированого пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущего дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы. К 5 мл Ni²⁺-(нитрилтриуксусная кислота)-агарозы, уравновешенной 50 мМ ТРИС-HCl буферным раствором (pH 8,0), содержащим 300 мМ NaCl, добавляли 25 мл раствора модифицированного пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущего дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы, в том же буфере (концентрация пропептида 1 мг/мл). Суспензию выдерживали, периодически перемешивая, 2 ч при 4°C, а затем переносили в колонку и промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,0), содержащего 300 мМ NaCl. Полученную Ni²⁺-(нитрилтриуксусная кислота)-агарозу с иммобилизованным модифицированным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущим дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы (4 мг/мл сорбента), использовали в качестве сорбента для очистки рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Для этого через колонку (1,5×2,5 см) с полученным иммобилизованным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущим дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы, с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis AJ73 (р31), pH которой предварительно доводили до 8 добавлением 1М NaOH. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,0), содержащего 300 мМ NaCl. Очищенный белок элюировали 10% раствором изопропанола в том же буфере.

Выход целевого продукта – рекомбинантной металлопротеиназы был в 4 раза выше, чем выход этого же белка при использовании известного способа [1]. При этом процесс проходит в одну стадию.

Пример 3. Очистка рекомбинантной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с использованием иммобилизованного модифицированного пропептида глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущего целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы. К 5 мл микрокристаллической целлюлозы для колоночной хроматографии, уравновешенной 50 мМ ТРИС-HCl буферным раствором (pH 8,5), добавляли 20 мл раствора (в том же буфере) модифицированного пропептида глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущего целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы. Концентрация пропептида 0,5 мг/мл. Суспензию выдерживали, периодически перемешивая, 2 ч при 4°С, а затем переносили в колонку и промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,5). Полученную целлюлозу с иммобилизованным модифицированным пропептидом глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущим целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы (2 мг/мл сорбента), использовали для очистки глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius. Для этого через колонку (1,5×2,5 см) с иммобилизованным модифицированным пропептидом глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущим целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы, с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis AJ73 (р58.21), pH которой предварительно доводили до 8,5 добавлением 1М NaOH. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,5). Очищенный белок элюировали 0,5 М раствором NaCl в том же буфере. Выход целевого продукта в 2 раза выше, чем при использовании известного способа [2] выделения и очистки этого же белка. При этом процесс проводится в одну стадию.

Пример 4. Очистка субтилизина с использованием модифицированного пропептида субтилизина.

Использовали пропептид субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp. Для его иммобилизации 2 г агарозы CNBr-активированной агарозы суспендировали в 10 мл холодной (4°С) 1 мМ HCl. Сорбент промывали на стеклянном фильтре 400 мл холодной (4°С) 1 мМ HCl и затем переносили в 8 мл раствора пропептида субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp (0,8 мг/мл) в 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3). Полученную смесь инкубировали при перемешивании 16 ч при 4°С, после чего сорбент переносили в 0,2 М раствор глицина (pH 8,0) и выдержали 2 ч при 20°С. Сорбент промывали 5 раз попеременно 50 мл 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3) и 50 мл 0,1 М уксусной кислоты, 0,5 М NaCI (pH 4), а затем 100 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,3). Полученную агарозу с иммобилизованным пропептидом субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp (1,5 мг/мл сорбента) использовали для очистки субтилизина. Для этого через колонку (1,5×2 см) с иммобилизованным пропептидом субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 168, pH которой предварительно доводили до 8,3 добавлением 1М NaOH. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствором (pH 8,3). Очищенный белок элюировали раствором пропептида субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp (1,2 мг/мл) в том же буфере.

Выход целевого продукта в 3 раза превышал выход сублицина, получаемого известным способом [3]. При этом процесс проводится в одну стадию.

Таким образом, способ согласно изобретению расширяет ассортимент средств, применяемых для хроматографического выделения и очистки белков. Способ реализуется в одну стадию и обеспечивает высокий выход очищаемого белка.

Формула изобретения

1. Способ хроматографического выделения и очистки белка, включающий двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропептидом этого белка, и последующее выделение белка элюцией из полученного комплекса, отличающийся тем, что на первом этапе приготовления комплекса получают иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка, который помещают в колонку с получением заполненной колонки, на втором этапе приготовления комплекса осуществляют контакт выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте его пропептидом путем пропускания раствора этого белка через заполненную колонку, а элюцию очищенного белка осуществляют из колонки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделяют и очищают природный, рекомбинантный, мутантный или модифицированный белок.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используют природный, рекомбинантный, мутантный или модифицированный пропептид выделяемого и очищаемого белка.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, используют ее природный пропептид, иммобилизованный на агарозе, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 7,5.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, используют иммобилизованный на агарозе ее модифицированный пропептид, несущий дополнительную последовательность из 6 остатков гистидина на амино-конце молекулы, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,0.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают глутамилэндопептидазу, продуцируемую Bacillus intermedius, используют ее иммобилизованный на микрокристаллической целлюлозе модифицированный пропептид, несущий на амино-конце молекулы целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы, продуцируемой Anaerocellum thermophilum, а элюируют глутамилэндопептидазу с колонки 0,5 М раствором NaCl в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,5.

7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают субтилизин, используют иммобилизованный на агарозе его пропептид с мутацией Glu⁵³-Asp, а элюируют субтилизин с колонки раствором его пропептида с мутацией Glu⁵³-Asp в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,3.