Патент на изобретение №2322495
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ И НОКАРДИОФОРМНЫХ АКТИНОМИЦЕТОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, агар, гумивит и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды. 7 табл.
Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано для изучения культурально-биохимических, хемотаксономических и генотипических свойств культур. Для роста микобактерий из-за их неспособности синтезировать различные химические вещества самостоятельно необходимы полноценные, богатые белком, углеводом, минеральными веществами и стимуляторами роста питательные среды. В медицинской и ветеринарной практике используют преимущественно плотные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2, содержащие солевую основу (среда Левенштейна-Йенсена – однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислый магний, аспарагин, глицерин химически чистый; среда Финн-2 – магний сернокислый, натрий лимоннокислый, квасцы железоаммиачные, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий глютаминовокислый однозамещенный глицерин, яйца и малахитовую зелень (в качестве деконтаминанта) [1]. Для научных целей предпочтительными являются питательные среды, содержащие солевую основу и агар с добавлением в них в качестве стимуляторов роста сывороток крови человека или животных (кроличья или бычья – среда Kirchner, лошадиная сыворотка – модифицированная среда Sauton), крови (венозная кровь – среда Pryce, цитратная кровь – среда Школьниковой), олеиновой кислоты (среда Dubos и Middlebrook) или комплексов, включающих витамины, жирные кислоты и др. (среда Bacto-Middlbrook) [2]. Многообразие питательных сред (плотных, жидких, полужидких), разнообразных по сложности составов и способам изготовления, свидетельствует об отсутствии универсальной питательной среды, что обусловливает актуальность поиска новых питательных средств, обеспечивающих хороший рост культур, включая культуры первой генерации, и визуализацию начального роста колоний. В качестве аналогов нами рассматриваются жидкая питательная среда Sauton, содержащая L-аспарагин, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду [3], и модифицированная жидкая питательная среда Sauton, содержащая дополнительно питательный агар (до 0,35%) и лошадиную сыворотку (25%) [4]. Известную модификацию питательной среды Sauton применяют для ускоренного определения лекарственной устойчивости клинических штаммов микобактерий туберкулеза к изониациду, стрептомицину, рифампицину, однако наличие в ней компонентов крови и жидкая консистенция не позволяют применять ее для научных целей, в частности для изучения ферментативной активности. Техническим результатом является повышение ростовых свойств питательной среды. Технический результат достигается тем, что питательная среда, содержащая L-аспарагин, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду, содержит 3,0% агара и дополнительно 9,0-9,5% гумивита. Гумивит – щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот – гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот [5]. Раствор солей гуминовых кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов [6, 7]. Гумивит – жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста. Сущность изобретения поясняется примерами. Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 40,0 г глицерина, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 1000,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН 7,1-7,2 добавлением 1н. NaOH или 1н. HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Горячую среду разливали по пробиркам по 3 мл и скашивали. Пример 2. В таблице 1 приведены варианты питательной среды в соответствии с изобретением.
Пример 3. Для определения эффективности среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Valle и BCG), M.tuberculosis (шт.Academia), Н37Ra, М.avium (шт.ГИСК, 44, 659), M.smegmatis (шт.53), М.phlei. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением 10 мкл суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Иенсена, на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (±слабый, +средний, ++обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль – традиционно применяемая среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблица 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления и более высокую интенсивность роста относительно варианта 1 питательной среды в соответствии с изобретением и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало срок появления роста и не влияло на интенсивность роста. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.
Пример 4. Для определения эффективности среды для культивирования нокардиоформных актиномицетов использовали референс-штамм Nocardia asteroids и четыре штамма родококков, выделенные от свиней и идентифицированные в лабораторных условиях. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур и учет результатов проводили как в примере 3. Контроль – традиционно применяемая среда Левенштейна-Йенсена. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.
Пример 5. Для сравнительного изучения информативности среды в соответствии с изобретением (вариант 3) и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-ЗЛ и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee, Ravenal БЦЖ), M.tuberculosis (шт.Academia), М.avium (шт.ГИСК и 659), M.smegmatis (шт.4), М.fortuitum и биологический материал от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Биологический материал предварительно обрабатывали по методу Аликаевой. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на известные среды и на среду в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры М.bovis (шт.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 6 и 7. Пример 6. Изучали жирнокислотный состав клеток колоний штаммов микобактерий туберкулеза BCG и Academia, снятых со сред Левенштейна-Йенсена, Павловского (оптимальной для получения бактериальной массы микобактерий и нокардиоформных актиномицетов для газохроматографического анализа) и питательной среды в соответствии с изобретением на газовом хроматографе Цвет-500. На хроматограммах эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды Левенштейна-Йенсена, установлены следы жирных кислот яичной среды. Хроматограммы эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды в соответствии с изобретением, отличались от хроматограмм эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды Павловского, более четкими пиками.
Проведенные исследования подтвердили эффективность питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов (сроки появления первичного роста и массивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Заявленная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний. Источники информации 1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. – М.: Агропромиздат, 1991. – С.120-121. 2. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. – Софрия, 1971. – С.146-175. 3. Там же, С.156. 4. RU 2226398 C2, 2004.04.10. 6.Левинский Б.В. Все о гуматах. – Иркутск: ИП Макаров С.Е., 1999. – 198 с. Формула изобретения
Питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит агар и гумивит при следующем соотношении компонентов:
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 18.04.2008
Извещение опубликовано: 27.12.2009 БИ: 36/2009
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||