Патент на изобретение №2322490

(54) ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERMICULATUM DANG.ВИЗР-24 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства биологических средств борьбы с фитопатогенными грибами. Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.РК-С получен селекционным путем из штамма РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.(BИ3P-3) и депонирован в коллекции чистых культур Всероссийского института защиты растений, ему присвоен номер ВИЗР-24. Предлагаемый штамм обладает высокой антагонистической активностью против широкого спектра возбудителей болезней растений. Максимальная антагонистическая активность штамма проявилась по отношению к Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary, Phomopsis helianthi Munt.-Cvet., Michal., Petr., Botrytis cinerea Pers. и Verticillium dahliae Kleb. Штамм обладает и значительной ростостимулирующей активностью, что проявляется в увеличении длины и веса корня проростков, полученных из семян, обработанных суспензией предлагаемого штамма. Штамм обладает устойчивостью (совместимостью) к ряду пестицидов, применяемых для защиты подсолнечника, зерновых, винограда от комплекса болезней и вредителей, что позволяет применять биопрепарат на основе штамма в интегрированной системе защиты растений. 9 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”4.2.1072-01 Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum РК-1-продуцент вермикулена в воздухе рабочей зоны. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Приложение к журналу «Защита и карантин растений», №4, 2003, с.421.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован при получении препарата против фитопатогенных грибов.

Известен штамм гриба РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.(ВИЗР №3) для получения препарата против белой и серой гнилей подсолнечника. Для получения препарата 30-дневную культуру гриба, выращенную на стерилизованной питательной среде, состоящей из семянок и лузги подсолнечника в соотношении 1:3, подсушивают и размалывают на мельнице до мелкодисперсного состояния (а.с. СССР №1476891, С12N 1/14, А01N 63/00, 1987 г. – прототип).

Недостатком известного штамма является то, что в процессе хранения и многократных пересевов он ослабил свою антагонистическую активность по отношению к возбудителям белой и серой гнилей подсолнечника, а также узкий спектр его антагонистической активности.

При создании изобретения ставилась задача получения препарата против фитопатогенных грибов на основе штамма, обладающего морфологической стабильностью, более высокой (по сравнению с известным) антагонистической активностью против возбудителей белой и серой гнилей, а также обладающего высокой активностью против широкого спектра грибных возбудителей болезней, ростостимулирующей активностью и устойчивостью к пестицидам, на основе отселектированного штамма.

Задача решается новым штаммом гриба Penicillium vermiculatum Dang., полученным из штамма РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.(ВИЗР №3) путем селекции с помощью ступенчатого отбора по признакам антагонистической активности и морфологической выравненности при выращивании на плотных питательных средах и на его основе получают препарат при твердофазном и глубинном культивировании с титром 4,0-8,3×10⁹ КОЕ/г.

Новый штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.РК-С депонирован в коллекции чистых культур Всероссийского института защиты растений и ему присвоен номер ВИЗР-24.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24

Морфологические признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 не отличались от исходного. Мицелий бесцветный, с возрастом темнеющий. Конидиеносцы бесцветные, септированные, прямостоящие, отходят от субстратного мицелия 10,0-15,0×1,7-2,4 мкм по 2-3 в мутовке. Фиалиды ланцетовидные, 8,0-12,0×1,7-2,5 мкм по 2-7 в мутовке. Конидии полуокруглые до эллиптических, 2,2-3,5×2,0-2,5 мкм, гладкие в массе коричневато-зеленые. Гриб имеет сумчатую стадию. Плодовые тела круглые, 200,0×500,0 мкм в диаметре, желтые. Перидий состоит из желтых, переплетенных инкрустированных гиф до 1,0-2,0 мкм толщины. Сумки круглые до широкоэллиптических, 8,0-12,0×7,5-10,0 мкм. Сумкоспоры широкоэллептические, 3,5-5,0×2,5-3,5 мкм, толстостенные, шиповатые, желтые, иногда с возрастом становятся красноватыми.

Культуральные признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 в сравнении с исходным РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-3 на разных агаризированных питательных средах и при различных температурах приведены в таблице 1.

На агаризированной среде из вытяжки семянок подсолнечника (вытяжка) колонии штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24 с лицевой стороны оливкового цвета, с обратной – коричневого, порошистые, при 20°С не сливаются, при 25 и 30°С – сливаются в единую колонию. Конидий образуется много (в массовом количестве), плодовых тел на этой среде нет. Рост мицелия 4 балла при температуре 20°С и 5 баллов при 25 и 30°С.

На агаризированной среде Чапека при всех температурах колонии сливаются, с лицевой стороны окрашены в оливково-желто-бежевый тон.

С обратной стороны среда окрашена в розовато-кремовый и кремово-зеленый тон. Плодовые тела в массовом количестве образуются при температуре 25-30°С. Рост мицелия при температуре 20°С – 4 балла, при температуре 25-30°С – 5 баллов.

На картофельно-сахарозном агаре (КСА) колонии штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 в отличие от исходного штамма сливаются в единую колонию, с лицевой стороны окрашены в оливковый и темно-оливковый тон, с обратной – в розовато-желтый и розовато-кремовый тон. Плодовые тела в массовом количестве образуются при температуре 25-30°С. Рост мицелия при 20°С – 4 балла, при температуре 25-30°С – 5 баллов.

Таким образом, отселектированный штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 растет быстрее исходного РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.BИ3P-3: рост мицелия заявляемого штамма ВИЗР-24 при температуре 20°С – 4 балла по сравнению с ростом исходного штамма ВИЗР-3 – 3 балла, а при температуре 25-30°С, рост мицелия ВИЗР-24 – 5 баллов, по сравнению с ростом мицелия ВИЗР-3 – 4 балла; диаметр колоний на 10-е сутки культивирования составил у ВИЗР-24 от 3,0×3,8 до 5,6×6,5 см, a у прототипа ВИЗР-3 – от 1,1×1,8 до 3,0×4,0 см.

Физиологические признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24

Аэроб. Температурный оптимум роста 25-30°С. Оптимальный pH в пределах от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост гриба отмечен на средах, где в качестве источника углерода использовали сахарозу, крахмал, мелассу, в качестве источников азота – хлористый аммоний, азотнокислый висмут, азотнокислый аммоний, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, глютен. Тиомочевина и мочевина как источник азота грибом не используется.

Поддержание культуры гриба производится на твердой питательной среде – картофельно-сахаразном агаре (КСА). Температура культивирования 25-30°С, продолжительность выращивания не менее 4-х суток, затем штамм может храниться в холодильнике при +4°С в течение года.

Штамм стабильно сохраняет морфологические свойства и антагонистическую активность в течение 10 пассажей.

Селекция исходного штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-3

Селекция исходного штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-3 осуществлялась методом ступенчатого моноконидиального отбора по признакам морфологической стабильности и антагонистической активности к возбудителю белой гнили, в результате которой получен штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24. У отселектированного штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 колонии морфологически однородные, с сильным ростом, занимающие в двойных культурах 80-100% площади питательной среды (пример 1).

Биологическая активность штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24 обладает высокой антагонистической активностью против широкого спектра возбудителей болезней растений. В двойных культурах штамм обладает способностью быстро занимать пространство питательной среды, не давая возможности расти патогену. Максимальная антагонистическая активность штамма проявилась по отношению к Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary, Phomopsis helianthi Munt.-Cvet., Michal., Petr., Botrytis cinerea Pers., Verticillium dahliae Kleb. Подавление роста мицелия Fusarium oxysporum var. orthoceras (Appl. et Wr.) Bilai и Sclerotium bataticola Taub было на 30,0% ниже (пример 2). Кроме того, штамм подавляет на 70-100% рост Fusarium gibbosum, F. moniliforme, F. sambucinum, F. graminearum, Rhizoctonia solani. Штамм на 60% подавляет жизнеспособность склероциев белой гнили.

Механизм действия штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 на возбудителей фитопатогенных грибов.

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24 является разрушителем гиф Sclerotinia sclerotiorum и других патогенных грибов. При соприкосновении колоний гифы антагониста обвивали гифы патогена в виде спирали. В дальнейшем, эффект обвивания еще более увеличивался, происходило проникновение гиф антагониста в стенки гиф патогена без образования апрессориев. Паразитическая активность антагониста приводила к разрушению клеточных стенок, грануляции цитоплазмы в гифах патогена, при этом разрушение цитоплазмы происходило и в соседних клетках, которые не были в контакте с гифами антагониста. Этот факт свидетельствует о наличии и антибиотического действия антагониста.

Таким образом, штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 обладает полифункциональным типом действия – конкуренцией, гиперпаразитизмом и антибиогенезом.

Препарат на основе заявляемого штамма относится к малоопасным веществам четвертого класса, не фитотоксичен, не токсичен для пчел.

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 обладает значительной ростостимулирующей активностью, что проявляется в увеличении длины корня и в увеличении веса корня за счет увеличения массы боковых корешков (пример 3).

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 обладает устойчивостью (совместимостью) к ряду пестицидов, применяемых для защиты подсолнечника, зерновых и винограда от комплекса вредителей и болезней, что позволяет применять биопрепарат на основе предлагаемого штамма в интегрированной системе зашиты растений (пример 4).

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от известного являются:

– более быстрый рост мицелия и в связи с этим более быстрое подавление возбудителя белой гнили в двойных культурах;

– морфологическая однородность;

– стабильность по антагонистической активности;

– расширенный спектр действия;

– ростостимулирующая активность;

– совместимость с рядом пестицидов.

Поскольку предлагаемый штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 получен впервые и на основании вышеуказанных его свойств можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критериям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень», а также «промышленная применимость», так как штамм может быть использован в сельском хозяйстве для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами получения и использования штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24.

Пример 1. Селекция штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-3 для получения штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24.

Из моноконидиального рассева природного изолята (Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-3) отбирали изоляты морфологически однородные, показавшие высокую антагонистическую активность в двойных культурах с возбудителем белой гнили для следующего моноконидиального рассева. Культуры, отличные от исходной, имеющие сектора с другим цветом, либо полностью изменившие цвет колонии, с низкой антагонистической активностью, отбраковывали (табл.2).

При сравнении структуры популяции исходного штамма ВИЗР-3 и отселектированного ВИЗР-24 методом двойных или встречных культур с возбудителем белой гнили установили, что у исходного штамма 15,1% колоний имели сильный рост, которые не давали начала роста колонии белой гнили, 62,7% – средний рост колоний, которые подавляли белую гниль на 7-10-ые сутки совместного культивирования, и 22,2% – слабый рост колоний, когда зарастание колоний патогена происходило на 12-15-ые сутки совместного культивирования. У заявляемого отселектированного штамма колонии морфологически однородные и имели 89,5% колоний с сильным ростом, 10,5% колоний со средним, ростом, а колонии со слабым ростом отсутствовали.

Пример 2. Антагонистическая активность штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 к возбудителям болезней подсолнечника.

Антагонистическую активность штамма в лабораторных условиях определяли методом двойных или встречных культур. Для этого грибантагонист и тест-культуру (возбудителей болезней) выращивали на картофельно-сахарозном агаре в чашках Петри при 25°С в течение 3-х суток. Затем стерильным лабораторным сверлом диаметром 5 мм вырезали агаровые блоки с растущими на них грибами, которые помещали в противоположные чашки Петри на питательную среду на расстоянии 5 см друг от друга. Контролем служили те же виды, выращиваемые отдельно. Учет скорости роста и характер взаимоотношений патогена и антагониста проводили на 3, 5, 10-ые сутки культивирования (таблица 3).

В отличие от исходного, предлагаемый штамм обладает расширенным спектром действия и проявляет более высокую антагонистическую активность к широкому кругу патогенов: к возбудителям фузариозов, фомопсиса, вертициллеза и пепельной гнили.

Штамм ВИЗР-24 подавляет рост Sclerotinia sclerotiorum, Phomopsis helianthi, Verticillium dahliae и Botrytis cinerea на 100%, Fusarium oxysporum – на 87,0% и Sclerotium bataticola – на 80,0%. Кроме того, штамм подавляет на 80,0-100% рост Fusarium gibbosum, Fusarium moniliforme, Fusarium sambucinum, Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani. Штамм на 70,0% подавляет жизнеспособность склероциев белой гнили.

Пример 3. Определение ростостимулирующей активности штаммов Penicillium vermiculatum Dang. на подсолнечнике.

Опыт проводили в лабораторных условиях. Семена подсолнечника замачивали в суспензиях заявляемого и исходного штаммов гриба, приготовленных смывом спор с поверхности твердой питательной среды дистиллированной водой, в течение 1 часа, а затем раскладывали в рулоны из фильтровальной бумаги, которые смачивали и помещали в термостат при температуре 23°С. Контроль – семена без обработки. Через 7 дней проводили учеты длины и массы корня (таблица 4).

Установлена более высокая ростостимулирующая активность заявляемого штамма-антагониста, которая проявляется в большем увеличении длины и массы корня.

Пример 4. Определение совместимости штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с пестицидами.

Совместимость штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с пестицидами определяли по модифицированному методу лунок (Егоров, 1976, Маслиенко, 1999). Для этого на поверхности агара в чашках Петри специальным стерильным сверлом вырезали отверстия – лунки, в которые закапывали пипеткой определенное количество раствора пестицида в рабочей концентрации. В центре чашки Петри помещали блок питательной среды с мицелием гриба-антагониста. По активности роста гриба и образованию зон вокруг лунок судили о совместимости биопрепарата и пестицидов (таблица 5).

Установлена совместимость штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с целым рядом пестицидов и фунгицидов, применяемых для защиты подсолнечника от вредителей и болезней: апроном, рониланом, ридомилом, максимом, космосом, семафором, линдафором. Кроме того, штамм совместим с рядом пестицидов, применяемых для защиты зерновых колосовых и винограда: купроситом, оксихомом, сапролем, арцеридом, деланом, импактом, байлетоном, золоном, фьюри.

Совместимость с пестицидами позволяет использовать биопрепарат на основе штамма в интегрированной системе защиты растений от комплекса вредителей и болезней.

Пример 5. Определение эффективности обработки семян подсолнечника порошком биопрепарата в зависимости от питательной среды и активности штамма-продуцента на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили в лабораторных условиях.

Для получения порошка биопрепарата штаммы ВИЗР-3 и ВИЗР-24 выращивали на твердых питательных средах, состоящих из смеси лузги и семянок подсолнечника в соотношении 1:3 (прототип) и из отходов от очистки семян подсолнечника на семяочистительных машинах, состоящих из невыполненных семянок подсолнечника, кусочков прилистников корзинок, трубчатых и язычковых цветков подсолнечника с добавлением 0,3% гумата натрия (вариант). Штаммы выращивали в течение 30 суток, затем питательный субстрат высушивали и размалывали на мельнице до мелкодисперсного состояния. Титр биопрепарата определяли по формуле:

где: Т – титр препарата КОЕ/г;

А – среднее количество колоний в 10 чашках Петри;

10ⁿ – конечное разведение препарата;

V – объем микробной суспензии, закапываемой в чашки Петри.

На питательной среде, состоящей из отходов от очистки семян подсолнечника наблюдалось более быстрое зарастание питательной среды (5-8-е сутки), более интенсивное спороношение гриба и, соответственно, более высокий титр готового препарата (7,3-8,3×10⁹ КОЕ/г против 1,9-2,5×10⁹ КОЕ/г).

Опыт проводили в лабораторных условиях, в растильнях, во влажной камере, на фоне искусственного заражения семян подсолнечника возбудителем белой гнили при температуре 22-23°С. Инфекционный фон создавали прикладыванием кусочков агара с мицелием возбудителя белой гнили к семянкам подсолнечника. Возбудителя белой гнили предварительно выращивали на картофельно-сахарозном агаре в течение 10-15 дней. Для создания влажной камеры дно растилен выстилали несколькими слоями фильтровальной бумаги, которую смачивали дистиллированной водой, затем растильни укрывали полиэтиленовой пленкой. Семена подсолнечника обрабатывали порошком биопрепарата с нормой расхода 2,0 кг/т, с увлажнением 20 л воды на 1 т. Контролем служили семянки подсолнечника без обработки биопрепаратами, с заражением возбудителем белой гнили (таблица 6).

Установлена более высокая эффективность против возбудителя белой гнили отселектированного (заявляемого) штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24, выращенного на питательной среде из отходов от очистки семян подсолнечника. Биологическая эффективность биопрепарата на основе штамма ВИЗР-24 составила 85,1-91,5% против 68,2-72,9% у известного штамма ВИЗР-3.

Пример 6. Испытание эффективности жидкой культуры вермикулена в лабораторных условиях на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили.

Глубинное культивирование штаммов ВИЗР-3 и ВИЗР-24 гриба Penicillium vermiculatum Dang. осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об/мин, в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, при объемах среды 150 мл, при температуре 27°С, на мелассо-солевой среде. Опыт проводили в лабораторных условиях, в растильнях, в условиях влажной камеры, на фоне искусственного заражения семян подсолнечника возбудителем белой гнили (как описано в примере). Титр глубинной культуры 2,0-2,7×10⁹ КОЕ/мл. Норма расхода препарата 3,0 л/т. Опыт проводили при температуре 23-24°С, в трех повторностях, в одной растильне 25 семянок, растильни ежедневно увлажняли (таблица 7).

На фоне поражения белой гнилью в контроле 74,0% установлена высокая эффективность применения биопрепарата на основе обоих штаммов. Биологическая эффективность препарата на основе штамма гриба ВИЗР-24 была выше, чем препарата на основе штамма ВИЗР-3, и составила 92,2% против 86,5%.

Пример 7. Полевые испытания композиции на основе биопрепарата вермикулена (глубинное культивирование) для защиты подсолнечника от болезней.

С целью применения биопрепарата вермикулена в интегрированной системе защиты подсолнечника от вредителей и болезней испытывали композицию, включающую биопрепарат (глубинное культивирование штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24, титр 2,0×10⁹ КОЕ/мл) с нормой расхода 3,0 л/т, апрон-голд с нормой расхода 1,0 л/т, для защиты от ложно-мучнистой росы и семафор с нормой расхода 2,0 кг/т для защиты от проволочников. Опыт проводили на делянках площадью 28 м², повторность четырехкратная. Сорт подсолнечника Р-453 (Родник). Расход рабочей жидкости – 10,0 л/т семян подсолнечника. Контроль – посев чистыми семенами. Эталон – фунгицид винцит с нормой расхода 2,0 кг/т в комплексе с апроном и семафором с теми же нормами расхода, что и в варианте. Посев ручными сажалками, уборка вручную, обмолот комбайном Hgst.

Опыт проводили на экспериментальной базе ВНИИМК на естественном фоне поражения подсолнечника вредителями и болезнями в 2005 г. (табл.8).

Установлена эффективность обработки семян подсолнечника композицией, включающей глубинную культуру биопрепарата, против фомопсиса 37,1-38,3%, при эффективности эталонной композиции 15,4-41,7% дополнительный урожай в вариантах с биопрепаратом составил 0,33-0,35 т/га, а в вариантах с эталоном – 0,30-0,41 т/га.

Пример 8. Испытание композиции, включающей биопрепарат, полученный на основе штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24, для защиты подсолнечника от болезней и вредителей в производственных условиях.

Производственные испытания инкрустирования композицией, включающей глубинную культуру биопрепарата на основе штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24, в 2005 г. проведены в Шовгеновском районе в колхозе “Победа” на сорте подсолнечника Р-453 (Родник). Эталон – винцит-форте с нормой применения 1,0 л/т. Композиция против ложно-мучнистой росы включала апрон-голд с нормой расхода 1,0 л/т, против проволочников – актеллик с нормой расхода 3,0 л/т (табл.9).

По сложившимся погодным условиям 2005 г. в республике Адыгея при позднем сроке посева поражение фомопсисом к моменту уборки в контроле составило 25,0%, фузариозом – 5,7%. На этом фоне биологическая эффективность против фомопсиса при обработке семян подсолнечника композицией, включающей биопрепарат на основе штамма ВИЗР-24 (глубинная культура), составила 90,7%, а эффективность эталона винцита-форте 37,3%. Против фузариоза биологическая эффективность эталона винцита-форте составила 47,1%, а биопрепарата на основе заявляемого штамма ВИЗР-24 – 70,6%.

Формула изобретения

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 для получения препарата против фитопатогенных грибов.