Патент на изобретение №2322450

(54) МОДИФИЦИРОВАННЫЕ 5′-ФОСФОНАТЫ АЗТ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к новым 5′-фосфонатам АЗТ общей формулы (I), обладающим анти-ВИЧ активностью и применению 5′-фосфонатов АЗТ в качестве активного компонента для приготовления лекарственных средств, обладающих анти-ВИЧ активностью. В общей формуле (I):

при n=0-2,

R¹= (где Х=СН₂, NH, О); R²-NH-C(O)- (где R²=Н, C₁-С₆алкил, С₅-С₇циклоалкил), HO(CH₂)_k– (где k=2-4); при n=0, R¹=Cl₃С; при n=1-6 R¹=Cl-, Br-, I-, и при n=2-6: R³C(O)O- (где R³-C₁-С₆алкил), при n=2-6. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”десорбции масс-спектрометрии производных нуклеозидов и нуклеотидов. – Молекулярная биология. – М., 1994, т.28, №3, с.708-13. О.А.МАМАЕВА И ДР. Изучение анти-HIV активности 5′-фосфонатов активности азидотимидина и фтортимидина. – Молекулярная биология. – М., 1994, т.28, №1, с.137-142. М.К.КУХАНОВА И ДР. Гидролиз 5′-фосфонатов и фосфатов нуклеозидов фосфатазами различного происхождения и сыворотками крови человека и теленка. – Молекулярная биология. – М., 1992, т.26, №5, с.1148-59. А.КРАЕВСКИЙ И ДР. Новые 5′-фосфонаты, модифицированные по сахарному остатку нуклеозидов как ингибиторы продукции ВИЧ. – Молекулярная биология. – М., 1992, т.28, №3, с.624-633. Н.В.ТАРУСОВА И ДР. Ингибирование ВИЧ репродукции в клеточных культурах 5′-фосфонатами 3′-азидо-2′,3′-дидеоксинуклеозидов. – Молекулярная биология. – М., 1989, т.23, №6, с.1716-24. ЯНВАРЕВ Д.В. И ДР. Аминокарбонилфосфонильные производные 3′-азидо-3′-дезокситимидина как потенциальные анти-ВИЧ-препараты. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов-2003”. Секция Химия. – М., Изд-во Хим. фак. МГУ, 15-18 апр., 2003, т.1, с.151. SOMOGYI GABOR ET AL. Targeted drug delivery to the brain via phosphonate derivatives II/Anionic chemical delivery system for zidovudine(AZT)”EInternational Journal of Pharmaceutics, 1998, 166(1)27-35. CASARA PATRICK J. ET AL. “Synthesis of acid stable5′-О-fluoromhetyl phosphonates of nucleosides. Evalution as inhibitors of reverse transcriptase” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1992, 2(2), 145-148. SOMOGYI G. ET AL. “Metabolic properies of phosphonate esters” PHARMAZIE, 2004, 59(5), 378-381. KRAEVSKII A.A. ET AL. “Nucleosides.156.5′-Hydrogenphosphonates and 5′-methylhosphonates of sugar-modified pyrimidine nucleosides as potential anti-HIV-1 agents”. Nucleosides & Nucleotides, 1992, 11(2), 177-96.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к новым производным нуклеозидов, а именно, к замещенным 5′-фосфонатам АЗТ. Эти соединения обладают противовирусным действием и могут быть применены для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека.

В настоящее время в медицинской практике используется целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении ВИЧ. Среди них различают нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы. Среди производных нуклеозидов наиболее часто применяются 3′-азидо-3′-дезокситимидин (АЗТ, Зидовудин®), 2′,3′-дидезоксицитидин (ddC, Зальцитабин®), 2′,3′-дидезоксиинозин (ddl, Диданозин®), 2′,3′-дидезокси-2′,3′-дидегидротимидин (d4T, Ставудин®) и 2′,3′-дидезокси-3′-тиацитидин (ЗТС, Ламивудин®) [De Clercq, E., 2002. New development in anti-HIV chemotherapy. Biochim. Biophys. Acta, 1587, 258-275].

Механизм действия указанных соединений состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилированию и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. Высокая изменчивость ВИЧ приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [Groschel, В., Cinatl, J.H., and CinatI J. Jr., 1997. Viral and cellular factors for resistance against antiretroviral agents. Intervirology, 40, 400-407; Antonelli, G, Turriziani, О., Verri, A., Narciso, P., Ferri, F., D’Offizi, G., and Dianzini, F., 1996. Long-term exposure to zidovudine affects in vitro and in vivo the efficiency of thymidine kinase. AIDS Res Hum Retrovir., 12, 223-228], и, следовательно, к необходимости смены препарата. К тому же из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов.

Следствиями токсичности АЗТ являются подавление деятельности клеток спинного мозга, нарушения функции печени и миопатия [Chariot, P., Drogou, I., De Lacroix-Szmania, I., Eliezer-Vanerot, M.C., Chazaud, В., Lombes, A., Schaeffer, A., and Zafrani, E.S., 1999. Zidovudine-induced mitochondrial disorder with massive liver steanosis, myopathy, lactic acidosis, and mitochondial DNA depletion. J. Hepatol. 30, 156-160; Kellam, P., Boucher, C.A., and Larder, B.A., 1992. Fifth mutations in HIV reverse transcriptase contributes to the development of high level resistance to zidovudine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1934-1938; Ren, J., Esnouf, R.M., Hopkins, A.L., Jones, E.Y., Kirby, I., Keeling, J., Ross, C.K., Larder, B.A., Stuart, D.I., and Stammers, D.K., 1998. 3′-Azido-3′-deoxythymidine drug resistance mutations in HIV-1 reverse transcriptase can induce long range conformational changes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 95, 9518-9523]. Быстрое выведение АЗТ из организма требует частого приема препарата. Кроме того, при длительном применении АЗТ достаточно быстро вырабатываются резистентные штаммы вируса и лечение теряет эффективность. Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, АЗТ по-прежнему остается наиболее широко применяемым анти-ВИЧ препаратом.

Известен Н-фосфонат АЗТ (Никавир®), одобренный в России для терапии СПИД, менее токсичен, чем АЗТ [Intracellular metabolism and pharmacokinetics of 5′-hydrohenphosphonate of 3′-azido-2′,3′-dideoxythymidine, a prodrug of 3′-azido-2′,3′-dideoxythymidine. Antiviral Reserch 63 (2004), 107-113]. Действие Никавира основано на способности высвобождать АЗТ, который после внутриклеточного превращения в АЗТ-5′-трифосфат ингибирует репликацию ВИЧ. По данным фармакокинетических исследований клинические преимущества Никавира объясняются более медленным и плавным нарастанием концентрации АЗТ в крови, чем при приеме собственно АЗТ; при этом С_макс АЗТ из Никавира <С_макс АЗТ из Зидовудина, a T_1/2 АЗТ из Никавира >T_1/2 АЗТ из Зидовудина [Y.Skoblov et al./Antiviral Research 63 (2004) 107-113]. Тем не менее, токсичность Никавира остается достаточно высокой. Другим недостатком является возникновение резистентности к Никавиру.

Данным изобретением решена задача создания низкотоксичных производных АЗТ, обладающих способностью проникать внутрь клетки и постепенно высвобождать активный нуклеозид (АЗТ). Это позволит поддерживать внутриклеточную концентрацию препарата, достаточную для проявления терапевтического действия в течение длительного времени, и, таким образом, снизить разовую дозу препарата и/или частоту приема и уменьшить побочные эффекты.

Задача решена созданием соединений 5′-фосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин общей формулы:

при n=0-2, (где Х=СН₂, NH); R²-NH-C(O)- (где R²=C₂-С₆алкил, С₅-С₇циклоалкил), HO(CH₂)_k– (где k=2-4),

при n=0, R¹=Cl₃С-,

R¹ означает Cl-, Br-, n=1-6 и R¹ означает R²C(O)O- (где R²-C₁-С₆алкил), при n=2-6.

Новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре перевиваемых лимфоцитов МТ-4, обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций (табл.1). Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50% токсические дозы на 2-4 порядка превышают 50% ингибирующие дозы) в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток МТ-4. Терапевтические индексы исследуемых соединений (IS), определяемые как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравнимы с таковыми для Н-фосфоната АЗТ. Вирусологические тесты проведены в соответствии с описанными ранее протоколами.

Показано, что заявляемые фосфонаты АЗТ в организме собак медленно высвобождают АЗТ, таким образом, представляя собой латентные формы АЗТ (Пример 10, табл.2). Исследования показывают, что для всех заявляемых фосфонатов единственным продуктом метаболизма, детектируемым в крови животных, является АЗТ. Фармакокинетические параметры, приведенные в табл.2, были определены по генерированному АЗТ и зависели от структуры фосфоната.

Целевые фосфонаты получали по следующей схеме в одну или несколько стадий:

Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1.

5′-Хлорметилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (Ia).

К раствору 3′-азидо-3′-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в триэтилфосфате (10 мл), охлажденному до 0°С, добавляли хлорметилфосфонилдихлорид (0,92 мл, 9 ммоль). Смесь перемешивали 18 часов при 18°С, разбавляли охлажденной смесью пиридина (10 мл) и воды (10 мл), перемешивали 30 минут и выливали в воду (700 мл). Раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой, элюировали в линейном градиенте NH₄HCO₃ (00,15 М). Целевые фракции упаривали, остаток разбавляли водой (3 мл) и дополнительно очищали на колонке с LiChroprep RP-18, элюируя водой. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 1 г (84%) фосфоната (Ia). ¹H ЯМР (D₂O): 7,72 kb (1H, J=0,5 Гц, H-6), 6,27 т (1H, J=6 Гц, Н-1′), 4,55 м (1Н, Н-3′), 4,21 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,58 д (2Н, J=8,5 Гц, СН₂-Р), 2,54 м (2Н, Н-2′), 1,95 д (3Н, J=0,5 Гц, 5-Ме). ³¹Р ЯМР (D₂O): 16,03 с.

Пример 2.

5′-(Диметиламиноэтиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (Ib)

К раствору 5′-этоксикарбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (300 мг, 0,75 ммоль) в смеси диоксан-вода (1:1, 5 мл), добавляли N,N-диметиламиноэтиламин (300 мг, 3,4 ммоль). Смесь перемешивали 18 часов при 37°С, упаривали, переупаривали с водой (10 мл), остаток наносили на колонку с LiChroprep RP-8, элюировали в линейном градиенте метанола (030%) в 0,01 М NH₄НСО₃. Фракции, содержащие продукт, упаривали, и повторно очищали на колонке с LiChroprep RP-8 в тех же условиях. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 230 мг (68%) 5′-(диметиламиноэтиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (1b). ¹Н-ЯМР: 7,66 с (1H, H-6); 6,22 с (1H, J=6,5 Гц, Н-1′), 4,47 м (1H, H-3′), 4,21-4,16 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,64 т (2Н, J=5,9 Гц, 3,31 т (2Н, 2,90 с (6Н, NMe₂), 2,47 т (J=6,4 Гц, 2Н, Н-2′), 1,82 с (3Н, 5-Ме). ³¹Р-ЯМР (D₂O): -1,97 с.

5′-(Триметиламмониоэтиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (Ic).

К суспензии 5′-(диметиламиноэтиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина ((1b), 90 мг, 0,2 ммоль) в триметилфосфате (1 мл) прибавили трибутиламин (0,1 мл) и перемешивали 3 суток при 37°С. Затем упаривали, переупаривали с водой (3×10 мл), остаток наносили на колонку с LiChroprep RP-8, элюировали в линейном градиенте метанола (015%) в 0,01 М NN₄HCO₃. Фракции, содержащие продукт, упаривали, и повторно очищали на колонке с LiChroprep RP-8 в тех же условиях. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 55 мг (61%) фосфоната (Ic). ¹Н-ЯМР (D₂О): 7,67 с (1H, H-6); 6,24 т (1H, J=6,5 Гц, Н-1′), 4,45 м (1H, H-3′), 4,20-4,11 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,74 т (2Н, J=6,7 Гц, 3,51 т (2Н, 3,17 с (9Н, NMe₃), 2,48 м (2Н, Н-2′), 1,82 с (3Н, 5-Ме). ³¹Р-ЯМР (D₂O): -2,30 с.

Пример 3.

5′-Метоксиметилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (Id)

Раствор пиридиниевой соли метоксиметилфосфоновой кислоты (1,2 ммоль) в пиридине (3 мл) прибавляли к раствору 3′-азидо-3′-дезокситимидина (267 мг, 1 ммоль) в пиридине (2 мл), прибавляли дициклогексилкарбодиимид (520 мг, 2,5 ммоль), реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 10 часов и разбавляли водой (5 мл). После 30 минут дополнительного перемешивания отделяли осадок, раствор упаривали, остаток растворяли в воде (100 мл). Раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой в НСО₃ ^–-форме, элюировали в линейном градиенте NH₄HCO₃ (00,15 М). Целевые фракции упаривали и переупаривали с водой (3 раза по 5 мл), остаток разбавляли водой (3 мл) и наносили на колонку с LiChroprep RP-18, элюировали водой. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 238 мг (63%) фосфоната (Ic). ¹Н ЯМР (D₂O): 7,66 кв (1H, J=0,5 Гц, H-6), 6,21 т (1H, J=6 Гц, Н-1′), 4,48 м (1H, H-3′), 4,15 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,68 д (2Н, J=8 Гц, СН₂-Р), 3,44 д (3Н, J=0,5 Гц, ОМе), 2,52 т (2Н, J=6 Гц, Н-2′), 1,94 д (3Н, J=0,5 Гц, 5-Ме). ³¹Р ЯМР (D₂O): 18,51 с.

Пример 4.

5′-(Циклогексиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (Ie).

Раствор 5′-этоксикарбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (80 мг, 0,2 ммоль) в циклогексиламине (1 мл) перемешивали 18 ч при комнатной температуре, а затем сконцентрировали в вакууме. Остаток растворили в воде и хроматографировали на DEAE-Toyopearl, элюировали в линейном градиенте NH₄HCO₃ (00,1 М). Получили 82 мг (87%) соединения Ie. ¹Н ЯМР (D₂O): 7,52 с (1H, H-6), 6,09 т (1H, J=6,5 Гц, Н-1′), 4,32 м (1H, H-3′), 3,98-4,10 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,51 м (1H, СН (ц-гексил)), 2,34 м (2Н, Н-2′), 1,75 с (3Н, 5-Ме), 1,41-1,61 м+0,95-1,16 м (10Н, 5СН₂ (ц-гексил)). ³¹Р ЯМР (D₂O): -1,34 с.

Пример 5.

5′-(Аминоэтиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (If).

К раствору 5′-этоксикарбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (80 мг, 0,2 ммоль) в этаноле (1 мл) прибавляли этилендиамин (1 мл). Через 18 ч при 37°С растворители упаривали в вакууме. Остаток растворили в воде и хроматографировали на DEAE-Toyopearl (в ОН^–-форме), элюировали в линейном градиенте NH₄HCO₃ (00,1 М). Получили 71 мг (85%) соединения If. ¹Н ЯМР (D₂O): 7,60 с (1Н, Н-6), 6,13 дд (1H, J=6,5 и 6,9 Гц, Н-1′), 4,41 м (1Н, Н-3′), 4,11 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,52 т (2Н, J=5,9 Гц, 3,12 т (2Н, J=5,9 Гц, 2,42 т (2Н, J=6,2 Гц, Н-2′), 1,82 с (3Н, 5-Ме). ³¹P ЯМР (D₂O): -1,90 с.

Пример 6

5′-(Гидроксиэтиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (Ig).

К раствору 5′-этоксикарбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (80 мг, 0,2 ммоль) в этаноле (1 мл) прибавляли аминоэтанол (1 мл). Через 18 ч при 37°С растворители упаривали в вакууме. Остаток растворили в воде и хроматографировали на DEAE-Toyopearl, элюировали в линейном градиенте NH₄НСО₃ (00,1 М). Получили 78 мг (90%) соединения Ig. ¹Н ЯМР (D₂O): 7,57 с (1Н, Н-6), 6,10 дд (1Н, J=6,5 и 6,9 Гц, Н-1′), 4,36 м (1Н, Н-3′), 4,04 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,54 дд (2Н, J=5,3 и 5,6 Гц, 3,28 дд (2Н, J=5,3 и 5,6 Гц, 2,36 т (2Н, J=6,2 Гц, Н-2′), 1,77 с (3Н, 5-Ме). ³¹Р ЯМР (D₂O): -1,41 с.

Пример 7

5′-(Гексиламино)карбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (lh).

К раствору 5′-этоксикарбонилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидина (80 мг, 0,2 ммоль) в этаноле (2 мл) прибавляли н-гексиламин (1 мл). Через 18 ч при 37°С растворители упаривали, остаток растворили в воде и хроматографировали на DEAE-Toyopearl, элюировали в линейном градиенте NH₄НСО₃ (00,15 М). Получили 78 мг (82%) соединения Ih. ¹Н ЯМР (D₂О): 7,68 с (1Н, Н-6), 6,23 т (1Н, J=6,5 Гц, Н-1′), 4,46 м (1Н, Н-3′), 4,17 м (3Н, Н-4′ и Н-5′), 3,22 дд (1H, J=6,5 и 6,9 Гц, CH₂N (гексил)), 2,47 м (2Н, Н-2′), 1,91 с (3Н, 5-Ме), 1,48 м+1,22 м (8Н, 4СН₂ (гексил)), 0,82 дд (3Н, J=5,9 и 6,9 Гц, СН₃ (гексил)). ³¹Р ЯМР (D₂O): -1,31 с.

Пример 8

5′-Трихлорметилфосфонил-3′-азидо-3′-дезокситимидин (Ii)

Раствор пиридиниевой соли трихлорметилфосфоновой кислоты (1,2 ммоль) в пиридине (3 мл) прибавляли к раствору 3′-азидо-3′-дезокситимидина (267 мг, 1 ммоль) в пиридине (2 мл), прибавляли при перемешивании дициклогексилкарбодиимид (520 мг, 2,5 ммоль), реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 10 часов и разбавляли водой (5 мл). После 30 минут дополнительного перемешивания отделяли осадок. Раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой в НСО₃ ^–-форме, элюировали в линейном градиенте NH₄НСО₃ (00,2 М). Целевые фракции упаривали и переупаривали с водой, остаток разбавляли водой (3 мл) и наносили на колонку с LiChroprep RP-8, элюировали водой. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 252 мг (56%) фосфоната (Ii). ¹Н ЯМР (D₂O): 7,54 с (1H, Н-6), 6,09 т (1H, J=6,7 Гц, Н-1′), 4,36 м (1H, Н-3′), 4,26 м (2Н, Н-5′), 4,03 м (1H, Н-4′), 2,34 м (2Н, Н-2′), 1,74 с (3Н, 5-Me).³¹P ЯМР (D₂O): 5,51 с.

Пример 9

Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии МТ-4 в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа – в течение 4 суток.

Ингибирование репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ).

Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведении в бессывороточной среде RPMI-1640 к клеточной суспензии МТ-4, помещенной в лунки 96-луночного планшета (“Cel-Cult”, England), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в течение 4 суток. Посевная концентрация составляет 0,5×10⁶ клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток МТТ). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀). Исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки МТ-4 в эффективных концентрациях. Следует также отметить, что 50% токсичные дозы на 2-4 порядков превышают эффективные в отношении ВИЧ-1 дозы (таблица 1).

Влияние исследуемых соединений на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 исследовано по известной методике.

Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе (результаты представлены в таблице 1). На основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемых соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4, сравнимой с эффективностью Никавира.

Пример 10.

Собаке весом 12 кг вводили 250 мг исследуемого вещества орально (в смеси с творогом). Через определенные промежутки времени отбирали пробы крови (1 мл) из бедренной вены. Пробы центрифугировали (10 минут, 2000 об/мин), супернатант отделяли. Из супернатанта отбирали аликвоты (0,25 мл), добавляли оксетан (0,25 мкг, как внутренний стандарт) и метанол (0,75 мл). Полученную смесь центрифугировали 3 минуты при 5000 об/мин. Супернатант отделяли и упаривали в токе воздуха при 40°С, к остатку добавляли воду (1 мл). Аликвоты (20 мкл) анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Gynkotec, Германия; аналитическая колонка Ultrasphere ODC “Beckman”, USA. Элюент: 6% ацетонитрил в 0,1% Н₃PO₄ (рН 2,1) в присутствии 0,15% три-этиламина. Детекция при _max 265 нм, температура 30°С. Фармакокинетические параметры, полученные в результате анализа данных, приведены в таблице 2.

Таблица 1 Противовирусная активность фосфонатов АЗТ против ВИЧ-1 ГКВ-4046
Соединение I		CD50, М			ID50, М			IS
n=1, R=Cl-		300			0,05-0,1			>3000
n=1, R=I-		>500			1-5			>100
n=1, R=HO-		>500			0,08-0,3			>1650
n=1, R=СН3О-		>500			1-5			>100
n=0, R=NH2C(O)-		>300			0,05-0,1			>3000
n=0, R=(CH3)3N+-(CH2)2-NHC(O)-		>350			0,06-0,15			>2300
n=0, R=(CH3)2N-(CH2)2-NHC(O)-		>350			0,9-2,5			>140
n=0, R=C6H10-NHC(O)-		>500			0,35-1,2			>400
n=0, R=NH2-(CH2)2-NHC(O)-		>350			0,3-0,7			>500
n=0, R=СН3-(СН2)5-NHC(O)-		>500			0,15-0,3			>1650
n=0, R=Cl3С-		>300			0,7-2,0			>150
Никавир		260			0,13			2015
Таблица 2 Фармакокинетические параметры азидотимидина после введения собаке внутрь 250 мг субстанций АЗТ, Никавира и фосфоната I (R=NH2C(O)-) в эквиваленте 250 мг АЗТ
Соединение	Т1/2, часы		AUC, мг. ч/литр	MRT, часы		CL, литр/час	Тмакс, часы		Cмакс, мг/литр
n=0, R=NH2C(O)-	9,6		9,24	13,9		27,0	5,0		0,74
Никавир	7,2		16,6	10,4		15,0	4,0		1,89
АЗТ	5,2		58,8	7,5		4,2	2,5		9,77

Таким образом, показано, что заявленные соединения обладают низкой токсичностью, способны эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток МТ-4 и генерировать АЗТ в организме млекопитающих, обеспечивая плавное нарастание его концентрации в крови.

Формула изобретения

1. 5′-Фосфонаты АЗТ, имеющие общую формулу

при n=0-2,

R¹=

(где Х=СН₂, NH); R²-NH-C(O)- (где R²-C₂-С₆алкил, С₅-С₇циклоалкил), HO(CH₂)_k– (где k=2-4);

при n=0,

R¹-Cl₃С-

R¹ означает Cl-, Br-, n=1-6 и R¹ означает R³C(О)О- (где R³-C₁-С₆алкил), при n=2-6.

2. Применение 5′-фосфонатов АЗТ, общей формулы

где n=0-2,

R¹=

(где Х=СН₂, NH, О); R²-NH-C(O)- (где R²=Н, C₁-С₆алкил, С₅-С₇циклоалкил), HO(CH₂)_k– (где k=2-4);

при n=0, R¹=Cl₃С;

R¹=Cl-, Br-, I-, и при n=1-6 и R³C(О)О- (где R³-C₁-С₆алкил), при n=2-6, обладающих анти-ВИЧ активностью, в качестве активного компонента для приготовления лекарственных средств.